劉存霞 ，費亦東 ，王銳 ，吳靜 ，田雪 ，趙巧雅 ，路曉 ，馬秀麗 **

（1.山東省農業科學院家禽研究所 家禽疫病診斷與免疫重點實驗室，山東 濟南 250023；2.吉林大學動物醫學學院，吉林 長春 130122；3.山東天牧生物科技有限公司，山東 東營 257500）

雞傳染性法氏囊病（IBD）最早是由Cosgrove于1957年在美國甘布羅鎮的肉雞群中發現的，目前該病已呈世界性流行。據報道IBDV分為兩種血清型，血清Ⅰ型對雞致病，Ⅱ型對火雞致病，目前報道的雞的IBDV疫苗毒、強毒株均屬于血清Ⅰ型。該病毒主要侵害禽類的免疫中樞腔上囊而導致雞本身免疫機能障礙，從而增加對其他病原如禽流感、新城疫、細菌、支原體的易感性，雖然IBDV本身的致死率不高，因其破壞家禽的免疫系統，仍需從根本上加強對IBD的防制。近年來IBD臨床病例減少，本試驗在吉林省內分離鑒定了IBD分離株，為該病的流行病學及防制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品、試驗動物和試劑 病料為2007年采自吉林大學動物醫院臨床送檢病死雞的法氏囊、脾臟，SPF（Specific pathogen free）雞胚購自哈爾濱獸醫研究所由本實驗室自行孵化，CEF細胞由軍事獸醫研究所病毒室制備。

IBDV瓊脂免疫擴散試驗陽性抗原、血清購自中國獸醫藥品監察所。Ex-Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker、Oligodt、 鼠源反轉錄酶、PCR產物連接試劑盒pMD18-T載體、T4DNA連接酶、BSA、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的兔抗雞IgY、RNA酶及各種限制性內切酶均購自TaKaRa公司和 Promega公司；RNA提取試劑盒TRIzol Reagent購自美國MD公司產品；PCR產物膠回收試劑盒為Axygen公司產品。

1.2 引物設計 根據Mundt E等報告的IBDV cDNA序列及GenBank已發表的IBDV序列，在同時編碼VP5和VP2兩種蛋白質的重疊基因保守性區設計一對引物（P1、P2）。

P1：5'-GGTCGGAGACTTCAACCTAC-3' ；P2：5'-TGAGAATTGGTAATCATCGG-3' ，擴增片段為536bp，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 病料處理 無菌條件下取法氏囊，放入滅菌的西林瓶中用剪刀剪碎后轉入玻璃研磨器中研磨，按1：5的比例加入滅菌生理鹽水，同時加入雙抗（終濃度 100μg/μl），于 4℃冰箱放置 2～4h，反復凍融三次，3000r/min離心15min取上清液，再經0.22μm濾器過濾除菌置-20℃保存備用。

1.4 RT-PCR檢測 取處理好的組織浸出液，用TRIzol Reagent試劑盒提取組織總RNA。依次加入 Rnase Free ddH2O 8μl、隨機引物 9mers 1μl、病毒 RNA 提取物 6μl，75℃ 5min，然后置于冰 盒 上 依 次 加 入 RNase Free ddH2O 5.5μl、5×RNA PCR Buffer 6μl、dNTP Mixture （10mmom/L）1.5μl、RNase Inhibitor 1μl、M-MLV 反轉錄酶 1μl，42℃孵育60min，95℃滅活5min完成反轉錄。配制25μl PCR 反 應 體 系 ：10×Ex Buffe 2.5μl、dNTPs(10mM)0.5μl、ExTaq 酶 0.25μl、上游引物（20pM）、下游引物（20pM）各 0.5μl，上述 cDNA 4μl，補水至 25μl，PCR 反應條件為：94℃預變性 3min；94℃變性 30s；55℃退火 30s；72℃延伸 40s；30 個循環，72℃再延伸 10min。

1.5 目的片段克隆測序 PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，用回收試劑盒對目的片段進行回收純化與pMD18-T載體連接過夜，轉化感受態DH5α細胞。提取重組子的經酶切鑒定陽性樣品送TAKARA寶生物大連有限公司進行測序。然后將所獲的序列在NCBI的Gene Bank中進行核酸序列比較。

1.6 病毒的分離與傳代 病毒在雞胚中傳代：取研磨液經雞胚絨毛尿囊膜接種SPF雞胚，0.1ml/胚，用醫用膠布封住卵窗并用石蠟封之。雞胚接種后，橫臥于溫箱中，不許翻動，保持卵窗向上。用檢卵燈每天檢卵一次，棄去24h內死亡的雞胚，37℃恒溫培養至144h，將死亡雞胚置4℃冷藏，收集尿囊膜經研磨、反復凍融3次后過濾除菌，連續傳代3～5代直至在雞胚接種后產生規律性病變。

病毒在CEF中傳代：取雞胚毒接種單層雞胚成纖維細胞（CEF），37℃ 5%CO2培養 3～5d，收獲細胞毒經反復凍融3次，繼續在CEF上接種傳代，連續盲傳數代直至出現明顯的規律性細胞病變。

1.7 毒價測定 將 CEF制成 1.0～1.5×106/ml細胞懸液，以106個/ml細胞加入到96孔板中制成單層細胞，將分離株細胞毒以10-4～10-9系列稀釋，分別接種CEF細胞與9～11日齡的SPF雞胚，重復3次，按照Reed-Muench法分別計算其對細胞和雞胚的 TCID50/0.1ml、EID50/0.1ml。

1.8 血清學鑒定 進一步驗證分離株特異性，參照中華人民共和國國家標準GB/T 17999.4-1999進行SPF雞瓊脂擴散試驗及血凝試驗。

1.9 電鏡觀察 收集新鮮制備的病毒液，用銅網在混合均勻的樣品管中蘸取少量液體，用濾紙吸干銅網周邊的液體，晾干后滴上一滴磷鎢酸染液，作用1min后，用濾紙吸干，在透射電子顯微鏡下進行觀察、拍照。

1.10 間接免疫熒光法檢測（IFA） 將細胞適應毒接種于含CEF細胞單層的爬片上，同時設正常細胞對照，37℃，5%CO2培養至細胞出現明顯病變后，取出玻片用 PBS（pH7.2）洗滌一次，2%戊二醛固定玻片 15～30min，PBS沖洗 3次，每次5min；用含3%BSA的PBS 37℃封閉2h，加入一抗（1：300稀釋），37℃作用 2h，PBS沖洗 3次， 每次 5min；加入二抗（1：1000稀釋異硫氰酸熒光素（FITC）標記的兔抗雞IgY），室溫避光作用1h，用PBS洗滌3次，每次5min，自然晾干；在載玻片上加一滴50%甘油PBS緩沖液，反扣于載玻片上于熒光顯微鏡下觀察。

1.11 動物回歸試驗 取分離株的細胞毒接種28日齡的SPF雞，每組30只，每只經滴鼻、點眼接種0.1ml，同時設空白對照5只，每天觀察并記錄發病情況，取法氏囊組織進行IBDV核酸檢測。

2 結果

2.1 RT-PCR電泳結果 分離株IBDV經總RNA提取后進行RT-PCR，電泳可見536bp目的片段與預期大小一致。用本實驗室保存的質粒pEX-IBDV-VP0作為陽性對照，電泳結果顯示可獲得536bp大小的目的片段，見圖1。

圖1 分離株RT-PCR產物電泳圖

2.2 目的基因克隆及序列比對 RT-PCR擴增片段與pMD18-T載體連接后，克隆到感受態菌體中，從而獲得重組質粒，經PCR電泳，結果獲得與預期目的大小一致的536bp片段，如圖2。所得的基因序列與NCBI中的Gene Bank中的核酸序列進行比較，同源性99%。

圖2 重組質粒PCR產物電泳圖

2.3 雞胚穩定性試驗 病料懸液接種9～11日齡SPF雞胚后，可造成雞胚死亡。連續盲傳至第5代時，IBDV分離株適應雞胚，雞胚死亡時間集中在44～96h，并逐步趨于穩定呈現一定的規律，病變部位及程度也出現明顯的規律性。剖檢死胚可見絨毛尿囊膜增厚水腫，死亡胚體周身水腫，發育不良，體表有明顯的出血現象，以頭部、背部、腿部出血較嚴重，肝臟腫大并有灰白色壞死灶，腎臟輕度腫脹，如圖3所示。

圖3 接種分離株IBDV 44～96h死亡的SPF胚

2.4 IBDV分離株在CEF中的穩定性試驗 IBDV分離株在CEF細胞中盲傳第6代時仍未出現任何細胞病變。直到第7代開始出現少量的細胞變圓、脫落的現象。繼續盲傳至第9代時開始出現明顯的細胞病變，且病變發生時間逐漸穩定，顯微鏡下可以明顯看到CEF細胞變圓、脫落、呈拉網狀。如圖4所示。結果表明，成功分離出IBDV，并使其適應CEF細胞。

圖4 IBDV分離株接種CEF病變圖

2.5 IBDV分離株毒價測定結果 將分離株分別在SPF雞胚及CEF中測定毒價，按照Reed-Muench法分別計算出0.1ml尿囊膜懸液中病毒JL-01 的 EID50分 別 為 104.5/0.1ml、104.75/0.1ml、104.5/0.1ml。 TCID50分別為 107.43/0.1ml、106.75/0.1ml、106.5/0.1ml。

2.6 血清學鑒定結果 瓊脂擴散試驗結果顯示分離株與IBD標準抗體之間出現明顯的單一的一條白色沉淀線，而陰性對照未見沉淀線。血凝試驗結果顯示待檢樣本未見有紅細胞凝集，而AIV、NDV陽性對照可見明顯的紅細胞凝集，表明無AIV、DNA污染。

2.7 電鏡結果 在透射電子顯微鏡下可以觀察到大小在60nm左右的、呈六邊形的散在的病毒粒子，除了完整的病毒粒子，也可見空衣殼，見圖5。

圖5 IBDV病毒粒子電鏡圖

2.8 IFA檢測結果 IFA檢測結果顯示，IBDV分離株感染CEF細胞后，經特異性抗體反應，在病變CEF細胞中可見明顯的綠色熒光，而正常細胞對照無特異性熒光，見圖6。

圖6 IBDV分離株的間接免疫熒光法檢測

2.9 動物回歸試驗結果 SPF雞于接種后第3天開始出現IBD的典型臨床癥狀：病雞精神萎頓，羽毛松亂，下痢、共濟失調。發病率100%，死亡率5%～20%。第4天開始死亡。剖檢可見胸肌、腿肌有片狀出血，法氏囊嚴重水腫，內含淡黃色膠凍樣滲出物，褶皺粘膜面上有針尖狀出血點，少數法氏囊彌漫性出血；胸腺萎縮，腎臟輕度腫脹、未見有尿酸鹽沉積；盲腸扁桃體腫大出血；接種30只SPF雞，死亡5只，死亡率為16.7%，對照組均未見明顯變化，見圖7。取法氏囊按1.3病料處理方法經PCR檢測為陽性。

圖7 SPF雞接種后出現IBD的典型臨床癥狀

3 分析與討論

本試驗參照周蛟[1]的方法在吉林長春地區對IBDV進行分離。Saijo K[2]研究認為，對法氏囊病毒的分離要經過在雞胚上的增殖后，才能適應CEF。李漢秋等將北京IBD-CJ801株IBDV經CEB傳9代，CEK傳8代，再在CEF上傳4代后，培育出了一株IBDV 毒株，毒價為 106.5～107.6TCID50/0.1ml。現在大多數實驗室都用CEF增殖IBDV，但并不是所有分離株都能適應于CEF[3]。本研究利用雞接種5代次取雞胚適應毒經CEF培養盲傳，盲傳至第7代開始出現少量細胞圓縮，繼續在CEF細胞中傳代至逐漸適應CEF細胞并產生有規律的CPE，通過對分離株的毒價測定，本試驗分離的IBDV的毒價與李漢秋在北京分離的病毒毒價相近。

研究發現國內散在IBDV強毒株感染[4-6]，由于傳染性法氏囊病是一種免疫抑制病，臨床中常因免疫失敗導致其他疫病感染的敏感性提高，本試驗在吉林地區分離了IBDV，并對其進行了鑒定，擬用分離的IBDV株作為攻毒毒株檢測實驗室自行構建的雞痘病毒載體活疫苗的免疫保護作用，為構建的重組雞痘病毒活載體疫苗及其免疫保護性研究奠定了基礎，對評價重組雞痘病毒活載體疫苗對環境中IBDV的保護性研究具有重要的意義。