番瀉葉中番瀉苷A、B的穩定性探究

胡 軍，畢海林，楊 敬，蘇 玲，肖裕章，潘 瑤，唐建華

(1.西南大學榮昌校區，重慶榮昌402460 ； 2.重慶方通動物藥業有限公司，重慶榮昌402460)

番瀉葉具有通便導滯，泄熱利水之功效，主治熱結積滯與便秘腹痛。現代藥理學研究表明，番瀉葉瀉下的主要成分為番瀉苷類，而其中又以番瀉苷A、B為主。哈飛和陳丹丹等[1-2]研究發現番瀉苷對熱不穩定，不能長時間加熱。故番瀉苷隨著溫度的改變可能會對番瀉葉顆粒劑等相關制劑的質量產生較大影響。為探究番瀉苷A、B在制備過程中的穩定性，本試驗以番瀉苷A、B的含量變化作為指標，考察不同條件下番瀉苷A、B的降解情況，為番瀉葉顆粒劑的研制與生產提供實驗依據。

1 儀器和藥品

1.1 儀器 PE2000型高效液相色譜儀(依力特公司)；HH系列數顯恒溫水浴鍋(上海江星儀器有限公司)；AB135-S型電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。

1.2 藥品 番瀉葉藥材，購自安徽省亳州市德昌藥業有限公司，經新疆藥物研究所鑒定為豆科灌木植物狹葉番瀉葉Cassia angustifolia vahl的干燥小葉；對照品番瀉苷A(中國食品藥品檢定研究院，批號110824—201301)、番瀉苷B(中國食品藥品檢定研究院，批號110825—201502)；甲醇和乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法和結果

2.1 番瀉苷A和番瀉苷B分析方法的建立

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取番瀉苷A﹑番瀉苷B對照品適量，置于50 mL的棕色量瓶中，加50%甲醇至溶解完全，定容至刻度，制成含番瀉苷A 53.9 μg/mL、番瀉苷B 91.9 μg/mL的混合溶液，搖勻，即得對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取番瀉葉粉0.5 g，置50 mL量瓶中，用50%甲醇溶解，超聲處理30 min，放冷，定容，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 色譜條件 Ultimate XB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈:5 mmol/L四庚基溴化銨的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH值=5)(35∶65)；柱溫40 ℃；流速1 mL/min；進樣體積20 μL；檢測波長340 nm。該色譜條件下番瀉苷A、B分離度良好，對照品及供試品的色譜圖見圖1。

圖1 番瀉苷A、B混合對照品(a)，供試品(b)的色譜圖

2.1.4 線性關系考察 用50%甲醇配制質量濃度為2.42、4.85、9.69、19.38、38.76、77.52 μg/mL和155.04 μg/mL番瀉苷A及2.95、5.91、11.83、23.65、47.30、96.40 μg/mL和189.20 μg/mL番瀉苷B系列對照品溶液，按照“2.1.3”項下色譜條件進行分析。以對照品峰面積(Y)對濃度(X)進行線性回歸，回歸方程為：番瀉苷AY=10 964X+40 111(R=0.999 9)；番瀉苷BY=11 227X+15 105(R=0.999 9)，表明番瀉苷A、B分別在2.42～155.04 μg/mL及2.95～189.20 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.5精密度試驗 精密吸取番瀉苷A、B對照品溶液各6份，按“2.1.3”項下色譜方法進行測定，得番瀉苷A峰面積RSD值為1.06%，番瀉苷B峰面積RSD值為0.87%，均小于2%(n=6)，表明所選用的儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 按“2.1.1”項下制備對照品溶液，分別于0、2、4、6、8 h進樣，按“2.1.3”項下方法測定，結果顯示,番瀉苷A峰面積RSD值為1.71%，番瀉苷B峰面積RSD值為1.22%，表明對照品溶液在該檢測系統和方法下，8 h內能夠保持穩定。

2.1.7 加樣回收率試驗 按“2.1.2”項下制備供試品溶液，得番瀉苷A供試品溶液濃度為19.38 μg/mL，番瀉苷B供試品溶液濃度為47.30 μg/mL，以供試品溶液的濃度為初始濃度。取適量番瀉苷A、B對照品于10 mL量瓶中，用供試品溶液溶解并定容，使加入的濃度約為初始濃度的80%、100%和120%，每一濃度進行3次平行試驗，按“2.1.3”項下方法進行測定，計算平均回收率。所得平均回收率番瀉苷A為98.92%，RSD值為1.03%；番瀉苷B為98.90%，RSD值為0.73%，結果見表1。

初始濃度/μg/mL加入量/μg加入濃度/μg/mL測得濃度/μg/mL回收率/%RSD/%番瀉苷A19.38148.20±1.3714.82±0.1434.01±0.3398.73±1.39214.86±3.0521.49±0.3140.71±0.5999.26±1.34240.72±1.2824.07±0.1343.15±0.2098.77±0.431.03番瀉苷B47.30391.74±2.1139.18±0.2186.26±0.2599.45±0.95494.32±3.4049.43±0.3496.03±0.3298.57±0.21553.30±5.0655.33±0.51101.89±0.2298.68±0.690.73

2.2 經典恒溫加速試驗 精密稱取1 mg番瀉苷A和B，分別用50%乙醇、50%甲醇、0.1%碳酸氫鈉和水充分溶解再密封于安瓿瓶中，將每個溶劑的安瓿瓶分為4組，分別放入50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃的恒溫水浴鍋中，即刻起記為0 h，恒溫加熱，于不同時間點取樣，溶液過0.45 μm濾膜，進樣20 μL，記錄峰面積。以0 h為100%，其他時間與0 h相比，計算藥物殘留百分率，以殘留率的自然對數對時間作圖，按lnCi=-kt/2.303+lnC0方程求得同一溫度、同一溶劑中的反應常數k，結果見表2。

由表2可知，溫度是影響番瀉苷A、B的主要因素，隨著溫度的升高，番瀉苷A、B的降解速率均增大，且番瀉苷B的降解速率大于番瀉苷A。根據Arrhenius公式求得同一溶劑的線性回歸方程及t0.9，并以溶劑為橫坐標，lnk為縱坐標對不同溶劑、不同溫度反應常數的自然對數作圖，結果見表3、圖2。

表2 番瀉苷A、B的一級動力學方程反應常數

表3 番瀉苷A、B的Arrhenius方程

圖2 番瀉苷A(A)和番瀉苷B(B)降解的溶劑速率圖

Ink:反應常數的自然對數(Ink值越大，則番瀉苷的降解速率就越快)

由圖2可以看出，隨著溫度的升高，番瀉苷A、B的k值逐漸上升，即溫度越高，番瀉苷A、B的穩定性越差；不同溶媒之間進行橫向比較，發現溶媒為50%乙醇和50%甲醇時，其k值低于溶媒為0.1%碳酸氫鈉和水的k值，故溶媒為50%乙醇和50%甲醇時，番瀉苷A、B的穩定性較好。

2.3 番瀉苷A、B在不同體積分數乙醇中的穩定性[3]選用30%、50%、70%和90%體積分數的乙醇作為考察因素。稱取適量番瀉苷A和B加入上述溶劑中溶解，分裝于不同安瓿瓶中，熔封，置70 ℃±2 ℃恒溫水浴鍋中進行加速試驗，于0、2、4、6、8 h時分別取樣20 μL，進樣，按“2.1.3”項下色譜條件進行分析，計算番瀉苷A、B的百分殘留率，結果見圖3。

從圖3可以看出，在70 ℃水浴條件下，番瀉苷A、B在30%和50%乙醇中穩定，而在70%和90%乙醇中均不穩定，尤其在90%乙醇中最容易降解；番瀉苷B比番瀉苷A在高醇中更不穩定，在70 ℃高溫條件下，加熱8 h，番瀉苷A在90%乙醇溶液中降解49.18%，而番瀉苷B則降解了88.13%。

3 討論

番瀉苷類化合物具有酚羥基和羧基，具有一定酸性，在堿水中成鹽而溶解，故可用碳酸氫鈉溶液溶解。此外，番瀉苷類化合物除了以游離酸的形式存在外，還以鈣鹽的形式大量存在于植物中，所以傳統方法中一般用水來提取番瀉苷。但也有文獻報道，加醇有利于番瀉苷類化合物的溶出[5]。

圖3 在70 ℃下番瀉苷A(A)、番瀉苷B(B)在不同體積分數乙醇中降解的殘留百分率

本試驗通過經典恒溫法考察番瀉苷A和番瀉苷B在不同溶劑、不同溫度和時間的穩定性時，發現溫度是影響番瀉苷A、B穩定性的主要因素，在高溫條件下，番瀉苷A和番瀉苷B易發生降解，且番瀉苷B的降解速率更快，這與于波濤等[5]的研究結果是一致的；此外，溶劑也會對番瀉苷A、B的穩定性產生影響，試驗發現，當溶媒為乙醇時，番瀉苷A、B的降解速率低于其他溶媒，通過番瀉苷A、B在不同濃度乙醇的穩定性的研究發現番瀉苷A、B在30%、50%等較低濃度乙醇(極性較大)中穩定，在70%、90%等高醇(極性較小)中容易降解，且在90%乙醇中降解速率最快，由于高醇的極性低于低醇，故番瀉苷的穩定性可能與溶媒的極性有關。此外，番瀉苷B降解速率比番瀉苷A更快，70 ℃水浴加熱8 h，番瀉苷B的降解速率是番瀉苷A的1.8倍。因此，在涉及番瀉葉相關制劑的制備工藝時，應充分考慮其穩定性。

除此之外，由Arrhenius方程可知：在溫度為70 ℃、溶媒為50%乙醇的條件下，番瀉苷A、B的半衰期分別為12.9 h和8.5 h，所以，提取、濃縮時選擇65 ℃±5 ℃較為適宜。