枯草芽孢桿菌對鉛暴露鯽魚的代謝及保護作用

張 蕾，郭曦堯，尹玉偉，茆安婷，代 靜，程 義，秦 悅，王云翔，李月紅

(吉林農業大學動物科學技術學院，吉林長春130118)

工業“三廢”、農業生產以及生活污水的大量排放，使得水體重金屬含量居高不下。目前，水體污染的重金屬主要包括鉛、汞、鎘、鋅、銅等。鉛作為一種在自然界中普遍存在的重金屬，具有不易降解、強神經毒性等特點，在微量條件接觸下便可對水生動物造成明顯的毒害作用[1]。在淡水系統中，魚樣品被認為是評估衡量重金屬污染潛力的最具指示性的因素之一，而重金屬在魚類組織中的生物積累最終會對人類健康造成威脅[2]。因此，在環境污染的背景下，研究重金屬在魚類機體中的生物蓄積及代謝不容置疑。

如今，利用微生物吸附法凈化養殖水質，從而達到改善和恢復養殖水體的生態環境，被越來越多地應用于生產[3]。研究顯示[4]，不少微生物材料在將重金屬濃度1 μg/mL降低到μg/mL的千分之一水平時具有很高的根除率。但是，對于微生物是否可以有效清除動物機體內重金屬含量的報道還較少。不少報道還指出[5]，益生菌不僅可以有效吸附重金屬離子，而且在緩解氧化應激與氧化損傷等方面有著顯著的表現。因此，本試驗嘗試將一株魚源性枯草芽孢桿菌添加至飼料中，通過檢測不同濃度鉛暴露鯽魚組織內含鉛量及軀干腎抗氧化酶活力變化，評價該菌種對其各組織中鉛代謝的促進及氧化損傷的緩解作用。從而為微生物飼料添加劑在重金屬中毒方面的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康鯽魚360尾，均質量60±1.65 g，由長春市新立城水庫提供。

1.2 主要試劑及儀器 試劑：三水合醋酸鉛[(CH3COO)2Pb·3H2O]，購自天津永晟精細化工有限公司。配置鉛溶液母液：10 mg/L Pb2+、稱取18.3 g三水合醋酸鉛，充分溶解于1 000 mL雙蒸水，配置好后置于密封瓶中保存備用；濃硝酸(HNO3)；濃高氯酸(HClO4)；鉛標準溶液；SOD、CAT、GSH及T-AOC試劑盒，均購自南京建成生物工程有限公司。儀器：日本島津AA-6880F/AAC型原子吸收分光光度計；Epoch2型微孔板分光光度計。

1.3 試驗設計 實驗鯽魚經兩周馴化飼養后，選取健康、質量相近的鯽魚隨機分為8個處理組，每個處理組3個重復，每個重復15尾魚。實驗Ⅰ組為對照組；實驗Ⅱ組為益生菌對照組；Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ組分別控制水體鉛濃度為0.05 mg/L Pb、0.5 mg/L Pb、1 mg/L Pb；益生菌治療組(Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ組)分別為0.05 mg/L Pb+WB600、0.5 mg/L Pb+WB600、1 mg/L Pb+WB600，實驗為期60 d。

1.4 飼養管理 試驗開始后每天8點和18點兩次投喂，按魚體重3%日投喂量飼喂。飼養水為充分曝氣的自來水，每缸水為80 L，每2天換一次，換水量為總量的1/3，水溫維持在24 ℃±2 ℃，水的pH值為7.2～7.4，水中溶解氧為7.2～7.6 mg/L，保持供養泵24 h開啟，實驗周期為60 d。

1.5 菌株活化及飼料制作 WB600為一株魚源性枯草芽孢桿菌，并保藏于-80 ℃冰箱中。參照《微生物學實驗技術》的方法并稍作修改，將該菌種接入LB液體培養基(pH值 7.2～7.4)中進行活化，按照2%接種量進行擴增，37 ℃條件下培養至穩定期，6 000 r/min(4 ℃)離心10 min，棄上清液得到菌泥，使用PBS洗滌，重復3次后重懸于無菌生理鹽水中(生理鹽水∶原菌液=1∶100)，將濃縮菌液用壓力噴嘴均勻噴入顆粒飼料中，現做現用。經過多次試驗確定菌液與飼料的添加比例為100 mL∶800 g，使飼料中活菌含量保持為109CFU/g。

1.6 樣品處理 組織采集冰盤上剖檢，取腦、鰓、肝胰臟、軀干腎、腸及肌肉，用4 ℃預冷的生理鹽水洗凈并用吸水紙吸干后置于無菌EP管中-80 ℃保存待用。

1.7 腦、鰓、肝胰臟、軀干腎、腸、肌肉中鉛濃度的測定 檢測前，準確稱取樣品，將樣品置于三角錐瓶中后放入數粒玻璃球，加入10 mL混合酸(HNO3∶HClO4=4∶1)并加蓋浸泡過夜。使用微波消解爐消解后消化液成無色透明或略帶黃色，待消化液冷卻，將其轉入25 mL容量瓶中，用去離子水少量多次洗滌三角錐瓶后洗液合并于容量瓶中定容，使用原子吸收光譜分析儀測定其鉛含量。用同一方法做試劑空白試驗。

1.8 軀干腎中抗氧化酶活力的測定 準確稱取組織重量后按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積生理鹽水，剪碎組織并在冰水浴條件下制備勻漿，2 500～3 000 r/min離心10 min，取上清待用。CAT、SOD、GSH及T-AOC測試的具體操作按南京建成生物工程公司試劑盒說明書進行。

1.9 數據處理與分析 試驗所得數據均用平均值±標準誤(x±SEM )表示，采用IBM SPSS Statistics 20軟件Tukey單因素分析法統計分析。試樣中鉛在魚體組織的含量按以下公式計算：

注：X：樣品鉛含量； C1：測定樣品鉛含量； C0：試劑空白液鉛含量； V：樣品處理后總體積； m：樣品質量

2 結果

2.1 臟器鉛濃度變化 如表1所示，與Ⅰ組相比，鯽魚各組織中鉛含量均顯著升高(P<0.05)，且與水體鉛濃度呈正相關。鉛在鯽魚的富集量取決于組織的不同，各組織鉛積蓄量由高到低依次為：鰓>軀干腎>腸>肝胰臟>腦>肌肉。在0.05 mg/L鉛暴露下，相比于Ⅳ組，Ⅲ組鯽魚鰓、肝胰臟、軀干腎、腸及肌肉鉛含量均顯著降低(P<0.05)，腦中鉛含量降低，無顯著差異(P>0.05)。在0.5 mg/L鉛暴露下，相比于Ⅵ組，Ⅴ組鯽魚腦、軀干腎、腸及肝胰臟中鉛含量顯著降低(P<0.05)，肌肉中鉛含量略微降低，無顯著差異(P>0.05)；Ⅴ組鰓中鉛含量低于Ⅵ組，但無顯著差異(P>0.05)。在1 mg/L鉛暴露下，相比于Ⅷ組，Ⅶ組鯽魚腦、軀干腎、腸及肝胰臟中鉛含量顯著降低(P<0.05)，肌肉中鉛含量降低，但無顯著差異(P>0.05)；Ⅶ組與于Ⅷ組鯽魚鰓中鉛含量，無顯著差異(P>0.05)

2.2 軀干腎抗氧化酶活性變化 如圖1～4所示，與Ⅰ組相比，Ⅱ組鯽魚軀干腎CAT、SOD、GSH及T-AOC水平均顯著提高(P<0.05)；在0.05 mg/LPb、0.5 mg/LPb及1 mg/L Pb濃度下，益生菌治療組鯽魚軀干腎CAT、SOD及GSH水平均顯著高于鉛暴露組(P<0.05)；相比于鉛暴露組，在0.05 mg/L Pb及1 mg/L Pb濃度下益生菌治療組鯽魚軀干腎T-AOC水平顯著提高(P<0.05)，在0.5 mg/L Pb濃度下無顯著差異(P>0.05)。

表1 鯽魚各組織鉛濃度 (ng/g)

注：標有不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，標有相同字母者表示差異不顯著(P>0.05)

圖1 軀干腎CAT活性變化

圖2 軀干腎SOD活性化

圖3 軀干腎GSH含量變化

圖4 軀干腎T-AOC活性變化

注：標有不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，標有相同字母者表示差異不顯著(P>0.05)

3 討論

3.1 不同濃度鉛暴露下鯽魚各組織鉛含量變化 鉛可通過表皮、腮溶解或經過消化道進入魚體。這種重金屬容易蓄積在魚體各組織，如腮、肝胰臟、腎臟等部位，并通過血腦屏障，從而對魚類的健康造成各種不利影響[6]。Meyer等[7]將小龍蝦暴露于20 mL/L鉛溶液和2 mL/L鎘溶液中處理10周后發現，鉛、鎘離子在消化腺及腮中累積量很高，而后腸和肌肉組織表現出很低的水平。Wu等[8]研究了白蝦在不同濃度鉛暴露下各器官鉛積累效應，結果顯示，所有研究的組織中，最低的鉛積累在肌肉組織中。其他相關報道也顯示[9-10]，鰓、軀干腎、腸道及肝胰臟等器官是魚類機體重金屬蓄積的主要器官，肌肉并不是主要的重金屬堆積組織。本試驗中，我們可以觀察到鯽魚各組織鉛含量與水體鉛濃度呈正相關關系。其中，鯽魚腮、軀干腎、腸及肝胰臟的鉛含量顯著高于腦和肌肉，這與以往的研究結論相似。腮絲含有極高濃度的鉛，可能是由于長期直接接觸含有鉛離子的水體所導致；而腦中所含鉛量較低表明，血腦屏障雖有一定的保護作用，但隨著時間及鉛濃度的提高，大量鉛離子依舊能進入腦組織中。Ewa等[11]通過飼喂普魯士鯉魚含鉛飼料后發現，鉛在不同組織中的生物蓄積濃度由高到低為：腎>肝>鱗>鰓>腸>肌肉>皮膚。這也表明，鉛通過不同途徑進入動物機體，其各組織鉛蓄積量也會不同。

3.2 枯草芽孢桿菌對鯽魚各組織的鉛代謝作用 相關研究顯示[12-13]，一些益生菌在體外對重金屬離子有很好的結合能力。Zhai[14]等的試驗已證明乳酸桿菌菌株對小鼠中的鎘和鉛毒性具有保護作用，通過口服乳酸菌有效的減少了小鼠腸道鎘及鉛的吸收，并減少了其他組織中鎘和鉛的積累。在本試驗中我們也可以看到，0.05 mg/L的鉛暴露下，益生菌治療組鯽魚腦、鰓、肝胰臟、軀干腎、腸及肌肉內鉛蓄積量均低于鉛暴露組。而0.5 mg/L及1 mg/L的鉛暴露下，益生菌治療組鯽魚腦、肝胰臟、軀干腎及腸鉛蓄積量均顯著低于鉛暴露組(P<0.05)，但鰓及肌肉中鉛蓄積量無顯著差異(P>0.05)；這是由于WB600僅通過口服方式進入鯽魚機體，水體中WB600的菌落數較少不足作為有效的重金屬吸附劑來清除水體中的鉛離子，因而導致在稍高濃度的鉛暴露下，益生菌治療組鯽魚鰓中鉛含量與鉛暴露組無顯著差異(P>0.05)。WB600可能通過靜電力或絡合反應吸附了腸道中大量的鉛離子，并加速腸道代謝，從而減少了鯽魚腸道中的鉛蓄積量。而WB600在鯽魚機體內或產生大量的次生代謝物，并隨血液流經鯽魚各部位，該產物可能是導致腦、肝胰臟及腎臟鉛含量降低的主要原因。

3.3 枯草芽孢桿菌對鯽魚軀干腎抗氧化酶活力的影響 大量鉛離子的進入導致了機體氧化應激反應的發生，而益生菌可促進或降低酶類抗氧化物的活性從而盡可能保證動物機體抗氧化系統的平衡[15]。Bhakta等[16]通過體外研究發現，益生菌具有降低由重金屬毒性引起的氧化應激；Balakrishnan等[17]以大鼠為試驗對象，對其皮下注射重鉻酸鉀后給予口服干酪乳桿菌，結果顯示，該菌株可保護腎臟等代謝器官免受來自重鉻酸鉀誘導的氧化應激。本試驗中，在3種不同濃度鉛溶液暴露下，鯽魚在口服WB600后其腎臟抗氧化酶活性均得到提高。這表明，該菌株對于鉛毒性起到了一定緩解作用。

如此看來，飼喂枯草芽孢桿菌能有效降低鯽魚機體各組織中的鉛積蓄量，提高機體抗氧化能力，減少鉛暴露造成的氧化損傷。該試驗結果可為枯草芽孢桿菌的應用提供理論依據，而其具有的易獲得、可大規模生產、安全性高、益生強等特點更值得推廣使用。