脂肪組織特異性Sirt6基因敲除小鼠發生非酒精性脂肪肝

韓在祺，崔佰吉，馮 波，姚 璐

(吉林醫藥學院，吉林吉林132013)

肝臟在調控糖脂代謝中發揮作用，通過合成和分解糖原以及糖異生途徑維持血糖平衡[1]。同時，肝臟是人體內合成甘油三酯和膽固醇的主要器官，也是脂蛋白合成及組裝的場所，肝臟將合成的甘油三酯以脂蛋白的形式進行轉運，以此維持脂肪在機體內的均衡分布[2]。非酒精性脂肪肝(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)是一種典型的代謝性疾病，以肝臟脂肪代謝異常和脂肪堆積為特點[3]。目前，NAFLD已經成為最常見的慢性肝臟疾病[4]。

Sirt6是Sirtuins家族的成員之一，定位于染色體，具有多種催化活性，包括：去乙酰化、去酰化和核糖基化等[5-7]。因此，Sirt6具有廣泛的底物基礎，能夠參與調控多種生理過程。雖然Sirt6基因敲除小鼠出生時表現正常，但是隨著生長發育Sirt6基因敲除小鼠會出現致死性的低血糖、淋巴球細胞明顯減少、皮下脂肪缺失和脊柱彎曲等缺陷，并在出生4周齡左右死亡，暗示Sirt6在調節機體糖脂代謝過程中具有不可忽視的作用[8]。基于此，我們構建了脂肪組織特異性Sirt6基因敲除小鼠模型，發現脂肪組織特異性Sirt6基因敲除小鼠發生漸進性肥胖[9]。考慮到肥胖是誘發非酒精性脂肪肝的重要危險因素，本試驗通過探討脂肪組織特異性Sirt6基因敲除對小鼠肝臟的影響，以期可以進一步明確脂肪組織Sirt6對肝臟糖脂代謝的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養 脂肪組織特異性表達Cre重組酶轉基因小鼠(Fabp4-Cre)與Sirt6條件基因敲除小鼠(Sirt6-floxed)均由吉林醫藥學院保存和傳代，動物統一編號，統一飼養。將Sirt6-floxed雜合小鼠與Fabp4-Cre小鼠交配的同時，將Sirt6-floxed雜合小鼠進行自交，如此，可以獲得Sirt6floxed/floxed小鼠和Fabp4-Cre;Sirt6floxed/+小鼠。利用Sirt6floxed/floxed小鼠和Fabp4-Cre; Sirt6floxed/+小鼠交配，獲得的Fabp4-Cre;Sirt6floxed/floxed小鼠，即為脂肪組織特異性Sirt6基因敲除小鼠(Sirt6ad-/-小鼠)，獲得的Sirt6floxed/floxed小鼠，即為野生型對照小鼠。小鼠斷乳后，普通飼料飼養的小鼠即開始以正常飼料喂養。對于采用高脂飼料飼養的小鼠，從出生后的第五周齡開始采用高脂飼料喂養，高脂飼料購自Research Diets公司(D12492)。

1.2 Western Blotting檢測 分別取兩種基因型小鼠的肝臟、心臟、腎臟、棕色脂肪組織、肌肉、大腦、脾臟和白色脂肪組織。用加入蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解并使用勻漿器破碎組織后，低溫360°旋轉1h，4 ℃離心取上清，采用BCA法測定蛋白濃度，加入適量蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min，分裝后-20 ℃保存。配置12% SDS-PAGE，對蛋白樣品進行電泳，轉膜，選擇抗目標蛋白的一抗孵育，洗膜，再孵育二抗，再洗膜，最后進行顯影和分析。Western Blotting方法檢測Sirt6(1∶800)的表達，驗證敲除效果，其中，Tubulin(1∶2 000)作為內參蛋白。

1.3 組織病理學檢查 蘇木素-伊紅染色(H.E.染色)：輕柔分離目的組織后，在4%多聚甲醛溶液中固定約48 h后，依次經脫水透明、浸蠟包埋、切片與貼片、脫蠟染色、脫水透明和封固等步驟后，使用光學顯微鏡觀察。免疫組織化學染色：輕柔分離目的組織后，在4%多聚甲醛溶液中固定約48 h后，經石蠟切片脫蠟和水化、抗原修復、封閉內源性過氧化物酶、封閉、除去封閉液并加一抗(anti-CD68)孵育、PBS沖洗、DAB顯色、蘇木素復染和封固后，使用光學顯微鏡觀察。

1.4 實時定量PCR檢測 使用TRIZ試劑從兩種基因型小鼠的肝臟組織中分離純化總RNA。利用反轉錄酶和隨機引物合成cDNA第一條鏈。利用基因特異性引物和SYBR Green實時定量PCR預混液，使用實時定量PCR儀對新合成的cDNA進行分析測定。利用ΔΔCt循環閾值方法分析數據。測定各目標基因轉錄水平是以Rps18(Ribosomal protein S18)作為內參基因，各組實驗中目標基因的mRNA水平表示為對照組表達量的數倍。所用引物的序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

1.5 數據處理 統計結果用SPSS 13.0軟件分析，所有數據均以(平均數±標準差)表示，顯著性水準為P<0.05。

2 結果

2.1 成功構建脂肪組織特異性Sirt6基因敲除小鼠 為驗證Sirt6ad-/-小鼠脂肪組織特異性Sirt6基因敲除成功，分別分離Sirt6ad-/-小鼠(KO)和野生型小鼠(f)的肝臟(Liver)、心臟(Heart)、腎臟(Kid)、棕色脂肪組織(BAT)、肌肉(SKM)、大腦(Brain)、脾臟(Spl)和白色脂肪組織(WAT)進行Western Blotting檢測，如圖1所示，與野生型小鼠相比，Sirt6ad-/-小鼠只有棕色脂肪組織和白色脂肪組織不表達Sirt6，其余組織器官均表達Sirt6，說明實驗中成功構建脂肪組織特異性Sirt6基因敲除小鼠模型-Sirt6ad-/-小鼠。

圖1 Western Blotting檢測Sirt6ad-/-小鼠和野生型小鼠不同組織中Sirt6蛋白的表達水平

2.2Sirt6ad-/-小鼠發生脂肪肝并伴有炎癥反應 脂肪肝會使肝組織形態學發生顯著變化，為此我們剖檢正常飲食Sirt6ad-/-小鼠和野生型小鼠并分離出完整的肝臟組織進行觀察(中插彩版圖2a)，發現與野生型小鼠結構致密、顏色鮮紅的肝臟相比，Sirt6ad-/-小鼠的肝臟組織松散腫大、泛黃、表面可見散在顆粒狀突起。原位解剖高脂飲食的兩種基因型小鼠，同樣發現，與野生型小鼠肝臟相比，Sirt6ad-/-小鼠的肝臟組織仍是松散腫大、表面可見散在顆粒狀突起(中插彩版圖2b)。取正常飲食兩種基因型小鼠的肝臟組織制作組織切片，進行H·E·染色，我們在Sirt6ad-/-小鼠的肝臟組織切片中觀察到肝細胞重度脂肪變性，脂肪空泡成片出現，細胞內的脂滴多為大泡型，有一些肝細胞的細胞核受脂肪空泡擠壓移至肝細胞邊緣，符合NAFLD表現(中插彩版圖2c)。正常肝細胞儲存脂肪的能力很小，超負荷的脂類沉積會影響代謝平衡，引起巨噬細胞浸潤[10]。對正常飲食和高脂飲食的兩種基因型小鼠肝臟進行免疫組化染色試驗，發現兩種飲食情況下Sirt6ad-/-小鼠的肝臟均對抗CD68的抗體產生明顯陽性反應，表明Sirt6ad-/-小鼠的肝臟發生巨噬細胞浸潤(中插彩版圖2d)。

2.3 脂肪組織特異性Sirt6基因敲除使小鼠肝臟中參與脂肪生成關鍵基因的表達增多 脂肪生成主要是指非脂肪底物合成脂肪的過程，即從乙酰輔酶A轉化成脂肪的過程，脂肪酸合成酶(Fas)和乙酰輔酶A羧化酶(Acc)是脂肪生成的關鍵酶，脂肪生成是造成肝臟脂肪沉積的重要原因[11]。此外，肝臟還可以通過Cd36攝入游離脂肪酸，增加肝臟中甘油三酯(TG)的含量[12]。利用實時定量PCR分析，我們發現，與野生型小鼠相比，兩種飲食情況下Sirt6ad-/-小鼠肝臟中Cd36以及參與脂肪生成關鍵基因的表達均有不同程度的升高(圖3a，b)。

圖3 脂肪組織特異性Sirt6基因敲除使小鼠肝臟中參與脂肪生成關鍵基因的表達升高

a:Real-time PCR分析正常飲食時Sirt6ad-/-小鼠(KO)和野生型小鼠(floxed)肝臟中Cd36和參與脂肪生成的關鍵基因的表達情況;b:Real-time PCR分析高脂飲食時兩種基因型小鼠肝臟中Cd36和參與脂肪生成的關鍵基因的表達情況。*P<0.05

2.4Sirt6ad-/-小鼠肝臟中炎癥因子的表達上調 過多的脂質沉積會造成肝細胞中線粒體、內質網和其他細胞器的功能異常，并引發炎癥反應。利用實時定量PCR分析，我們發現與野生型小鼠相比，兩種飲食情況下Sirt6ad-/-小鼠肝臟中炎癥標記物的表達水平均有不同程度的上調(圖4a，b)。

圖4Sirt6ad-/-小鼠肝臟中炎癥因子的表達上調

a:Real-time PCR分析正常飲食時Sirt6ad-/-小鼠(KO)和野生型小鼠(floxed)肝臟中炎癥標記物的表達;b:Real-time PCR分析高脂飲食時兩種基因型小鼠肝臟中炎癥標記物的表達。*P<0.05

3 討論

Sirt6ad-/-小鼠會發生漸進性肥胖，肥胖伴隨有脂肪細胞體積的變大，當循環系統輸送的養分不能夠滿足體積增大的脂肪細胞所需時，脂肪細胞會呈缺氧狀態并使HIF-1α被激活，導致脂肪細胞死亡[13]。死亡的脂肪細胞會將原本儲存于脂滴中的脂類釋放到周圍組織中，游離的脂類會促使巨噬細胞浸潤到脂肪組織中將游離脂類消滅，當巨噬細胞缺乏將游離脂類全部吞噬的能力時，游離的脂類會隨循環系統進入到肝臟等不宜儲存脂類的組織器官中[14-15]。過多的脂肪沉積會對肝臟造成脂質毒性，使肝細胞中的細胞器功能異常，導致巨噬細胞浸潤和炎癥反應[16]。本試驗中，脂肪組織特異性Sirt6基因敲除不僅使小鼠的肝臟發生脂肪沉積和炎癥反應，還使小鼠肝臟中負責攝入游離脂肪酸和參與脂肪生成的關鍵基因表達上調。

雖然肥胖極有可能是導致Sirt6ad-/-小鼠發生非酒精性脂肪肝的重要原因。但不能忽略的是，脂肪組織具有內分泌功能，它能夠分泌多種脂肪因子調節糖脂代謝，如:瘦素、脂聯素、降脂素等[17-19]。已有研究發現，脂肪組織尤其是棕色脂肪組織可以通過分泌Nrg4抑制肝臟的脂肪生成，從而抑制脂肪肝的產生[20]。本試驗還不能排除脂肪組織特異性Sirt6基因敲除影響脂肪因子分泌的可能性，因此，要明確脂肪組織特異性Sirt6基因敲除使小鼠發生脂肪肝的機制以及脂肪組織Sirt6對機體糖脂代謝的調控作用還需要后續試驗進行深入研究。