氨芐青霉素殘留免疫學檢測方法研究進展

張巖蔚，張冬昊，李佳儀，何 擴，魏 東

(1. 河北北方學院食品安全研究中心，河北張家口075000 ； 2. 河北省農產品安全檢測重點實驗室，河北張家口075000)

隨著全球經濟一體化和食品貿易國際化，食品安全問題已成為關乎人類身體健康和社會和諧的重要問題。由于抗生素的大量使用，動物源性食品中的獸藥殘留問題已經引起了全社會的關注。

青霉素(Penicillin)類藥物是歷史最悠久的抗菌素，是由青霉菌中提煉出的抗生素，其分子中含有青霉烷，能破壞細菌的細胞壁，并在細菌的繁殖期間有著殺菌的作用。青霉素屬于β-內酰胺類抗生素，因其效率高、毒性低等特點[1]，被廣泛應用，其中氨芐青霉素是畜牧養殖過程中常用的青霉素類藥物之一，它是在青霉素G側鏈羧基的α位引入氨基(圖1)，改變其極性，是半合成的青霉素，對革蘭陰性菌和陽性菌均能產生不同程度的抑制作用[2]。由于氨芐青霉素耐酸不耐酶的特性，避免了天然青霉素不宜內服的缺點，在臨床中得到了廣泛的應用[3]，主要被用于治療鏈球菌和金黃色葡萄球菌感染的如乳腺炎、膿腫、敗血癥，以及其他細菌、真菌感染的如炭疽、破傷風、關節炎、放線菌病等畜禽常見疾病。

圖1氨芐青霉素分子結構

氨芐青霉素注射后吸收迅速，血藥濃度較高，但下降也快。就注射的起始濃度而言，皮下注射或肌肉注射均較低，即使增加注射量也達不到靜脈注射所產生高的血藥濃度。氨芐青霉素吸收后分布均勻，用藥之后在有炎癥的腦脊液、胸腹水等均可達到有效的藥濃度[4-5]，其中膽汁中藥物濃度遠比血藥濃度高。

然而隨著氨芐青霉素的大量使用，使得動物體內的耐藥致病菌很容易感染人類，人們長期食用含氨芐青霉素殘留的動物源性食品后，可造成藥物蓄積，當達到一定濃度后便會對人體產生毒性作用，如過敏、“三致”(致畸、致癌、致突變)作用等。2006年，高建新[6]等人對江西省市售的進口、國產的嬰幼兒奶粉以及液態奶中的抗生素殘留進行了調查，結果發現：國產的和進口的嬰幼兒奶粉抗生素檢出率分別為34.40%和0.00%，液態奶的檢出率為15.27%。2015年，Attaie R[7]等發現牛奶中含有多種抗生素等。氨芐青霉素殘留影響著動物源性食品的安全以及畜牧業的可持續發展，直接或間接危害了人類的身體健康和生命安全，對人類的危害極其之大。因此，檢測氨芐青霉素殘留是當前檢測動物性食品安全的重要指標之一，而準確、快速、大批量的檢測方法便成為現在最受歡迎的檢測方法。

目前，國內外用于檢測氨芐青霉素殘留的方法有很多，主要有理化檢測法、微生物檢測法和免疫分析法[8]。高效液相色譜-串聯質譜法是一項高效、準確、靈敏的檢測技術，可用于分離高沸點、相對分子質量大、熱穩定性差的有機化合物，也用于各種離子的分離分析，從而進行準確的定性分析或者精確的定量分析，適用于殘留藥物的確證；微生物檢測法是檢測抗生素殘留較為傳統的一種方法，主要是根據抗微生物藥對特異性微生物的生理功能以及代謝過程的抑制作用來定量或定性檢測樣品中殘留的抗微生物藥類[9]；免疫分析法是根據抗原或半抗原與相應抗體可發生特異性結合的性質，利用酶或其他有色、發光物質對特定抗體(或抗原)標記使其作為選擇性試劑對相應待測抗原(或抗體)進行定性或定量分析的一種方法。

由于HPLC-MS法前處理較復雜，所用儀器也較昂貴，并且需要專業的檢測人員進行操作，難以實現大量樣品的現場快速檢測，因此不易進行普及；微生物檢測法雖然原理和操作過程較簡單，適合于藥物的快速篩選，但是由于其時間長、檢測限過高、靈敏度過低、特異性差，因此也不能大量的推廣；而免疫分析法中，由于抗原與抗體分子間具有高度互補的立體化學、氫鍵、范德華力和疏水區域的綜合作用，因此具備了任何單獨的一種理化分析技術都難以達到的高選擇性、高特異性和高靈敏度，并且檢測過程中特別是前處理階段十分簡單，在大批量、復雜的介質中依舊能進行微量痕量組分的檢測，檢測速度快，是一種檢測成本低且相對獨立的快速檢測方法[10]，適合于現場大量樣品的快速篩選，因此被廣泛應用。

本文主要對氨芐青霉素殘留檢測的必要性和對氨芐青霉素的免疫學檢測方法進行了分析。

1 氨芐青霉素殘留的危害及檢測的必要性

1.1 氨芐青霉素殘留的危害 氨芐青霉素解決了人類的許多問題，如治療消化道、呼吸道感染等，同時也在治療動物疾病、促進動物生長以及畜產品質量等方面起到了重要作用。但是，隨著氨芐青霉素的廣泛應用，總有部分人為了追求更好的治療效果，常出現藥物濫用或超劑量使用的現象，最終導致動物源性食品中出現嚴重的藥物殘留[11]，人長期食用含氨芐青霉素殘留的動物性食品后，可造成藥物蓄積，當達到一定濃度后便會對人體產生毒性作用，同時還會對畜牧的發展產生一定的影響，主要有以下幾種：

1.1.1 細菌耐藥性增強 動物機體長期反復食用含有某種抗菌藥物的飼料后，其體內敏感菌株受到選擇性的抑制，使機體內的耐藥菌株大量繁殖。而這些含有抗生素殘留的動物源性食品被人食用后，人體也會產生耐藥性菌株，同時動物體內的耐藥菌株的耐藥性也有可能轉移到人體中，使得一些常用藥物的療效下降甚至失去療效，治愈難度大大增加[12]。以前機體感染某種病菌，只要服用針對這種病菌的抗生素便可治愈，而現在這種病菌具有多種抗藥性基因，一種抗生素已經起不到作用，必須多種抗生素同時使用才能治愈[13]。

1.1.2 過敏反應 長期食用抗生素超標的動物源性食品，會使部分人群發生過敏反應，輕者出現惡心、嘔吐、皮疹、血壓下降、呼吸困難等癥狀，嚴重時會導致過敏性休克甚至危及生命。青霉素類藥物引起的過敏性反應主要有接觸性皮炎和皮膚反應、胃腸道紊亂引起的惡心、嘔吐等。氨芐青霉素屬于半抗原，不能使機體產生相應的抗體，但它進入體內后很容易發生降解或者與蛋白發生反應生成完全抗原，進而使機體產生相應的抗體[14]。當這些被致敏的人長時間使用氨芐青霉素超標的動物源性食品后，機體中的抗體便會和氨芐青霉素結合生成抗原抗體復合物，從而致使人發生過敏反應，過敏性反應一般發生在用藥后20 min內。

1.1.3 腸道菌群失調 人體內正常會寄生著大量的菌群，主要分為敏感菌和不敏感菌兩種，它們的存在對身體的健康起著重要的作用[15]。一旦機體長期與動物源性食品中殘留抗生素接觸，就會使一些敏感性非致病菌被抑制或死亡，不敏感的耐藥菌或條件性致病菌大量生長繁殖導致雙重感染，擾亂腸道微生物平衡，從而導致長期的腹瀉或引起維生素的缺乏等反應，同時還容易造成病原菌的交替感染，使得具有選擇性作用的抗生素及其他化學藥物失去療效。

1.1.4 影響乳制品的發酵 氨芐青霉素對熱的穩定性比其他常用的抗生素都好，一般的加熱殺菌根本起不到破壞作用[28]。從乳品加工的角度來看，原料乳中抗生素殘留嚴重干擾發酵乳制品的生產，可嚴重影響干酪、黃油、發酵乳的起酵和后期風味的形成[16]。酸牛乳生產過程中所用的發酵劑嗜熱鏈球菌是一種乳酸菌，青霉素對其的抑制最為強烈，一般情況下，當青霉素含量達到0.05 IU/mL～0.10 IU/mL時便會影響乳酸菌的生長繁殖，而含量達到1 IU/mL時乳酸菌的生長會被完全抑制[17]，牛乳酸化凝結進程明顯變慢。

1.1.5 影響畜牧的正常發展 長期濫用抗生素嚴重制約著畜牧業的健康持續發展，如長期使用抗生素容易造成畜禽機體免疫力下降，影響疫苗的接種效果；還可引起畜禽內源性感染和二重感染；使得以往較少發生的細菌病(大腸埃希菌、葡萄球菌、沙門菌)轉變成為家禽的主要傳染病。此外，耐藥菌株的增加，使有效控制細菌疫病變得越來越困難。

1.2 氨芐青霉素殘留檢測的必要性 氨芐青霉素殘留影響著動物源性食品的安全以及畜牧業的可持續發展，直接或間接危害了人類的身體健康和生命安全，對人類的危害極其之大，最后的結果也是十分嚴重。因此，想要讓人們放心的食用動物源性食品，必須完善畜產品安全質量的保障措施，對動物源性食品的獸藥殘留進行檢測和監管，進而對有害的動物性食品進行處理，防止其流入市場。加強氨芐青霉素藥物的監控，重點搞好藥物的殘留檢測及分析方法，對保障畜產品質量、維護人體健康、保護人類賴以生存的生態環境具有重要意義[18]。世界各國對氨芐青霉素在動物源性食品中制定了最高殘留限量(MRL)。歐盟藥典規定的氨芐青霉素殘留限量標準4 μg/kg，1997年日本制定了抗生素在牛奶中的MRL為0.1 mg/kg，我國農業部2002年也規定了氨芐青霉素在牛奶中的MRL是10 μg/kg，在可食組織中的MRL為50 μg/kg[19]。雖然我國制定了《動物性食品中獸藥最高殘留限量》以及《飼料藥物添加劑使用規范》，但是抗生素殘留現象依舊十分嚴重，建立一種準確、快速、簡便的氨芐青霉素殘留免疫檢測方法是十分必要的。

2 氨芐青霉素殘留的免疫檢測技術

免疫反應即是抗原-抗體反應，其最大特點是具有高靈敏度和強特異性，抗原抗體復合物的親和指數通常為109或者更高。免疫檢測技術主要是以抗原與抗體的特異可逆性結合反應為基礎的檢測技術。

氨芐青霉素是一種小分子的半抗原，雖然能夠與抗體結合，但是不能刺激機體產生相應的抗體，必須和一種載體蛋白結合，偶聯成為全抗原后才能作為免疫原免疫小鼠。載體蛋白物質由于分子量較大，并且有較好的異源性，與獸藥偶聯后可使動物的免疫系統發生應答反應，其主要有牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血藍蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、人血清蛋白(HAS)等。然而在選擇載體蛋白時，應盡量減少蛋白造成的背景干擾[20]。為了防止蛋白的結構發生變化，應在條件溫和的水溶液中進行小分子物質與載體蛋白的偶聯反應，盡量避免高溫、強酸堿等極端環境。

氨芐青霉素和大分子蛋白質偶聯主要有兩種方式：第一種是利用待測獸藥上已有的活性基團(-COOH、-NH2、-OH、-SH、鹵素等)，通過雙功能試劑，如NH2(CH2)nC(x)H、戊二醛、琥珀酸酐等，引入連接臂和活性基團，使之與載體蛋白偶聯，此方法比較容易實施，但是如果這些活性基團代表著其特征結構或偶聯后改變了分子的電子分布，便會影響抗體對待測獸藥的識別；第二種方法是直接合成帶有-(CH)nCOOH、-(CH)nNH2等結構的待測獸藥的衍生物，這種方法有利于保護待測獸藥的特征結構，使分子的電子分布不受影響，但是合成過程較復雜，一般需要多步反應才能合成[21]。偶聯的方法一般由半抗原上的活性基團所決定，主要有碳二亞胺法、戊二醛法、琥珀酸酐法、混合酸酐法、重氮化法等，其中碳二亞胺法、混合酸酐法用于羧基半抗原與載體的偶聯，戊二醛法、重氮化法用于氨基半抗原與載體的偶聯，琥珀酸酐法用于帶有羥基的半抗原與載體的偶聯。

目前常用的免疫分析方法有酶聯免疫吸附法(ELISA)、熒光免疫檢測方法(FIA)、膠體金免疫層析法(CGIA)、免疫傳感器分析法(ISA)等。

2.1 酶聯免疫吸附法(ELISA) 酶聯免疫吸附法是酶免疫測定技術中應用最廣的技術，主要是以固相材料為載體來吸附抗原或抗體的一種免疫分析方法，最早在1971年由Weemen和Perlmann分別提出，該方法具有靈敏度高、特異性好、檢測成本低、檢測速度快等優點，已被廣泛應用于醫學、環境科學、生物、化學等方面。該方法主要是將抗原或抗體結合到某種固相載體的表面，使其保持免疫活性，然后將抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既有酶的活性又具有與固相載體表面抗體或抗原特異性結合的活性，最后加入酶的底物，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與樣品中被檢物質的量具有直接的關系，所以可以根據顏色的深淺來進行定性或定量分析。根據抗原抗體反應的機理不同，ELISA可分為直接法、間接法、雙抗體夾心法和競爭法4種，其中雙抗體夾心法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原；競爭法可用于抗原和半抗原的測定，也可用于抗體的測定，其測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌后再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應。

陸彥[10]采用碳二亞胺法將氨芐青霉素與匙孔嘁血藍蛋白(mc KLH)偶聯制備免疫抗原，與牛血清白蛋白(BSA)偶聯制備包被抗原，利用間接酶聯免疫吸附法對Amp-KLH 偶聯物免疫小鼠產生的抗體進行檢測，建立了對氨芐青霉素的ELISA檢測方法。采用間接競爭 ELISA 方法建立檢測 Amp 的標準曲線，在0.5 ng/mL～100 ng/mL 范圍內呈線性相關，回歸方程為 y=0.0569x+0.1308，R2=0.9948。

張正挺等[22]利用競爭法將青霉素酶包被在酶標板上，通過氨芐青霉素與辣根過氧化物酶的連接制備了酶結合物，經過配方的優化開發出檢測牛乳中氨芐青霉素含量的檢測試劑盒，其靈敏度達到了4 μg/kg。

2.2 熒光免疫檢測方法(FIA) 熒光免疫檢測方法作為免疫分析法的一種，由于熒光色素不但能與抗體球蛋白結合，用于檢測或定位各種抗原，也可與其他蛋白質結合，用于檢測或定位抗體，但在實際工作中熒光抗原技術應用很少，因此，也被稱為熒光抗體技術。抗體與熒光素結合后并不影響其與相應的抗原發生特異性反應，用熒光素標記的抗體與切片中組織細胞中的抗原相結合，若熒光標記抗體與相應抗原發生特異性結合反應，則洗滌分離后不會被緩沖液沖掉，然后用熒光檢測儀觀察抗原抗體復合物的特異性熒光強度，進而對樣品中微量或超微量物質進行定量測定。FIA操作簡單，現象直觀，可進行示蹤觀察，具有專一性強、靈敏度高等特點，被用于測量含量較低的生物活性化合物。熒光免疫檢測方法主要分為非均相熒光免疫測定和均相熒光免疫測定，其中非均相熒光免疫測定又包括時間分辨熒光免疫測定(TRFIA)和熒光酶免疫測定，均相熒光免疫測定包括熒光偏振免疫測定(FPIA)等。由于熒光免疫分析法背景熒光干擾較大，因此需選擇合適的熒光試劑以及合適的樣品處理方法以減少非特異性吸附蛋白的影響。

王云云[23]選擇熒光發射波長分別為520 nm、565 nm和610 nm的3種量子點通過共價鍵偶聯作用分別標記鏈霉素、四環素和青霉素G的抗體，從而獲得3種量子點抗體探針,即OD520-抗鏈霉素抗體、OD565-抗四環素抗體和OD610-抗青霉素G抗體，以3種量子點抗體探針為基礎建立了直接競爭熒光免疫分析法，通過對免疫條件的分析得到最佳條件，采用陣列分析模式實現了對鏈霉素、四環素和青霉素G的同時靈敏的可視化檢測，研究出3種抗生素檢測的線性范圍分別為0.01～25 ng/mL、0.01～25 ng/mL和0.01～10 ng/mL，檢測限均達到了0.005 ng/mL。本研究建立的方法比其他分析牛奶中相應3種抗生素的方法具有更高的靈敏度和準確度。

2.3 膠體金免疫層析法(GICA) 膠體金免疫標記技術創于20世紀70年代，主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處可在顯微鏡下看到黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時可肉眼看見紅色或粉紅色斑點。由于膠體金具有肉眼可觀測的紅色，便以膠體金作為示蹤標志物或顯色劑，應用于抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術。膠體金免疫層析法是膠體金標記技術和蛋白質層析技術的結合，是以條狀纖維層析材料為固相，將各種反應試劑分點固定在測試板上，通過毛細管作用使樣品溶液在層析條上移動，使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體發生高特異性和高親和性的免疫反應，形成的復合物被富集或固定在層析條上的特定區域(檢測線)，通過酶反應或直接形成肉眼可見的標記物膠體金，一般只需幾分鐘就能得到準確結果。膠體金免疫層析檢測技術具有使用方便、檢測時間短、穩定性好以及生產成本和檢測成本均較低等優點，在臨床醫學檢測、激素檢測、食品安全檢測、藥物殘留和毒品快速檢測以及抗原抗體分析等諸多領域有著迅速的發展。

張鴻等[24]利用鞣酸還原法制得的膠體金標記氨芐青霉素單克隆抗體，對建立膠體金免疫層析快速檢測氨芐青霉素殘留方法進行研究。成品試紙條PBS中氨芐青霉素的檢測限為50 ng/mL，牛奶加標樣品中氨芐青霉素的檢測限為100 ng/mL，檢測范圍在0～1 000 ng/mL。

孫志文等[25]應用膠體金免疫層析法對牛奶中的β-內酰胺類抗生素和三聚氰胺殘留進行檢測，結果表明，其檢測限分別為青霉素G 2 μg/L、氨芐青霉素3 μg/L、阿莫西林4 μg/L、鄰氯青霉素6 μg/L、雙氯青霉素6 μg/L、三聚氰胺50 μg/L，假陽性率不大于5%，假陰性率為0，特異性好，與牛奶中其他抗生素無交叉反應。

2.4 免疫傳感器分析法(ISA) 免疫傳感器作為一種新興的生物傳感器，主要以鑒定物質的高度特異性、敏感性和穩定性的特點受到人們廣泛的青睞。它是將傳統胡免疫測試和生物傳感技術結合起來，將兩者的優點采納，不僅減少了分析時間、提高了靈敏度和測試準確度，也使得測定過程變得簡單，易于實現自動化操作，減少了對使用者及環境技術條件的依賴，在現場或野外進行快速篩選測定有著廣闊的應用前景。傳感器的生物敏感層與復雜樣品中待測的目標分析物之間通過抗體與抗原之間的識別功能，產生一些物理化學信號，如顏色、光、熱、電化學等變化，通過不同原理的傳感器，如光敏管、熱敏電阻、壓電裝置、光極、離子選擇性電極等將其轉換成第二信號，經放大后顯示結果或記錄。利用氨芐青霉素與特異性抗體結合反應的特性研制出的免疫傳感器，可用于氨芐青霉素藥物殘留進行快速定量定性檢測[3]。

王明華等[26]針對動物性食品安全問題中的青霉素獸藥殘留快速檢測的免疫傳感器分析法進行研究，主要關注直接固定抗體、直接檢測方法的性能穩定性。通過采用分子模擬的研究方法對其可能的影響操作步驟和檢測條件-牛血清白蛋白封閉的過程進行深入探索，以固定抗體的活性，改進免疫傳感器的構建方式，獲得較穩定的性能。免疫傳感器采用硫辛酸自組裝單分子層膜將氨芐青霉素抗體固定于壓電金電極上作為生物識別元件、以石英晶體微天平作為檢測器構建，對不同封閉過程產生的影響進行研究，比較免疫傳感器實物試驗與分子模擬的研究結果。

張婉潔等[27]提出了一種新的利用基于表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)的生物光學傳感器檢測多種殘留物的方法。通過引入分子標記技術，在修飾有羧甲基葡聚糖的芯片表面固定一層抗分子標記物BSA的抗體，通過對待測樣品的孵育，使其對多種殘留物的檢測轉化為對同一標記物的檢測。使用分子標記物BSA對卡那霉素、三聚氰胺、氨芐青霉素和鏈霉素進行標記，并對其水溶液進行檢測，檢測限分別為50 μg/L，10 μg/L、1.25 μg/L 和10 μg/L，均低于各自的最大殘留檢測限(MRL)。該檢測方法解決了競爭抑制法在檢測時傳感器專一性的問題，實現了傳感器的通用性，同時也可以推廣到其他免疫法檢測的領域，使免疫傳感器、免疫試紙等通用性增強。

3 展望

氨芐青霉素是治療動物疾病的常用β-內酰胺類抗生素類藥物之一，在動物源性食品中的殘留對人類有著嚴重的危害，因此AMP殘留的檢測越來越受到重視，選擇特異性強、靈敏度高、高效快速的檢測方法尤其重要。傳統的檢測方法樣品前處理較復雜，并且需要大型儀器，而免疫分析技術的引用解決了這些問題，實現了在線、實時、檢出限低、靈敏度高、選擇性好、可大批量制備的快速檢測。例如ELISA法的取樣量小、前處理簡單，不需要大型儀器，檢出限與HPLC-MS不相上下，而分析效率則是HPLC-MS的幾十倍以上。目前國內外已經有許多商品化的試劑盒，取得了巨大的成就，但是還存在難以實現商業化的問題。隨著科學技術的日益進步，試驗儀器的便捷化、微型化成了檢測方法的發展趨勢，免疫學檢測技術在氨芐青霉素藥物殘留檢測方面必然會有更廣闊的發展和應用前景。