EGCG抑制HBV復制的分子機理研究

王平 劉國輝 詹森林 袁靜 吳其愷

518112深圳市第三人民醫院

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶中茶多酚的主要組成成分。在干的綠茶葉子中，EGCG的含量占據所有茶多酚的59%左右［1］。EGCG具有廣譜抗病毒作用，可有效抑制乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）、登革病毒（dengue virus，DENV）、基孔肯雅病毒（chikungunya virus，CHIKV）、寨卡病毒（zika virus，ZIKV）、EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）等多種病毒的復制［1］。 在抗 HBV方面，有研究報道，EGCG可阻止 HBV與其受體NTCP 結合［2］，并抑制 HBV DNA 復制、HBV RNA 和HBV cccDNA合成等多個過程［3-4］。然而，EGCG調控宿主細胞因子，進而抑制HBV復制的分子機理卻鮮 有 報 道［5］。 HNFs（hepatocyte-enriched nuclear factors）是宿主肝細胞中調控基因表達的一類轉錄因子的總稱。有研究報道，在眾多的HNFs蛋白亞型中，HNF4α在HBV復制的細胞模型中表達上調，并促進HBV的復制［6］。考慮到EGCG可調控基因轉錄［7-9］，此次研究了EGCG對HNF4α表達的影響以及HNF4α在EGCG介導的抗HBV信號通路中的作用。研究發現：（1）EGCG顯著下調HepG2.2.15細胞中HNF4α的表達；（2）在Hep.2.15細胞中，利用siRNA沉默HNF4α的表達，顯著降低HBV DNA的含量；（3）在 siRNA介導的 HNF4α沉默的細胞中，EGCG對HBV復制的抑制作用變弱。綜上所述，本研究提示，EGCG通過下調HNF4α的表達可能是其發揮抗HBV作用的一種重要途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 EGCG（CAS：989-51-5）購自百靈威科技公司；CCK-8檢測試劑盒（C0037）購自Beyotime公司；GAPDH 抗體 （＃5174）和 HNF4α 抗體（＃3113）購自 Cell Signaling Technology公司；特異沉默 HNF4α 編碼基因的 siRNA（siRNA ID：144546）和對照 siRNA（siRNA ID：142980）采購自 Thermo Fisher公司；引物購自上海生工；逆轉錄試劑和熒光定量PCR試劑購自TaKaRa公司；DMEM培養基、胎牛血清（FBS）、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶、Opti-MEM培養基、轉染試劑 lipofectamine 2000購自Thermo Fisher公司；細胞培養板購自康寧公司。

1.2 Hep G2.2.15細胞的培養 HepG2.2.15細胞接種于DMEM細胞培養基（DMEM＋10% 胎牛血清＋1% 青霉素和鏈霉素）中，置于37℃ 5%CO2細胞培養箱中培養。

1.3 EGCG處理Hep G2.2.15細胞 EGCG溶解于DMSO中，4℃ 避光保存。HepG2.2.15細胞培養24 h后，去除細胞培養基，并用PBS洗兩遍。在細胞培養板中加入含有25μmol／L EGCG的DMEM細胞培養基，于37℃細胞培養箱中培養48 h，分別收集細胞培養基和細胞備用。

1.4 基因沉默實驗 將HepG2.2.15細胞接種于不含抗生素的DMEM培養基中（DMEM＋10%FBS）培養12 h，用PBS緩沖液清洗細胞兩次后將細胞培養基換成Opti-MEM。每個12孔中Opti-MEM的體積為0.5 ml。在細胞轉染時，每個孔的siRNA用量為80 pmol，lipofectamine 2 000的用量為1.5 μl。加入轉染試劑后，在37℃ 細胞培養箱中培養6 h，然后在每個孔中補加Opti-MEM，至終體積1 ml。繼續在37℃ 細胞培養箱中培養細胞48 h后，分別收集細胞和培養基，進行下一步實驗。

1.5 HBV病毒顆粒的純化和檢測 HBV病毒顆粒的純化參照前人發表的文章［10］。根據HBV病毒顆粒在細胞內和細胞外分布的不同，HBV DNA的提取步驟稍有不同。細胞培養基中HBV病毒顆粒的純化步驟如下：收集細胞培養基，2 000×g離心力的條件下，室溫離心2 min，去除細胞殘渣。在500 μl的細胞培養基中，加入等體積的沉淀劑（20%PEG 8000 ＋1.5 mol／L NaCl），4 ℃過夜沉淀，16 000×g離心30 min，所得沉淀即含有HBV顆粒。將HBV 顆粒重懸于緩沖液中（40 mmol／L Tris-HCl，pH 8.0，10 mmol／L MgSO4，1 mmol／L CaCl2），并加入DNase I（終濃度為2U），37℃水浴加熱30 min后，65℃加熱10 min。在上述溶液中加入10%體積的2%的 SDS和蛋白酶 K（終濃度為 0.5 mg／ml），55℃ 水浴加熱1 h后，用磁珠法純化HBV DNA（詳見天根磁珠純化試劑盒DP710說明書）。細胞中的HBV病毒顆粒的純化方法如下：細胞經RIPA裂解液（碧云天）裂解后，于12 000×g離心力下離心30 min，取上清液200μl，加入等體積的沉淀劑沉淀。后續操作與培養基中HBV顆粒的純化方法相同。通過熒光定量PCR的方法檢測HBV DNA的含量。HBV特異性引物序列參照文獻［10］，具體序列如下： HBV-f（5’-AGTGTGGATTCGCACTCCT-3’），HBV-r（5’-GAGTTCTTCTTCTAGGGGACCTG-3’）。PCR反應體系和方法參照TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書。

1.6 RNA的提取、逆轉錄以及HNF4αmRNA水平檢測 本研究中，采用相對熒光定量PCR的方法，檢測 HNF4α在轉錄水平的相對含量。利用TRIZOL試劑提取細胞中的總 RNA，經逆轉錄（TaKaRa，RR047a）合成cDNA。熒光定量 PCR所用的引物序列參照文獻［6］，具體序列為：HNF4α-f（5’-CAGGACCCACCAGACACGTC-3’）， HNF4α-r（5’-TCGAGGCACCGTAGTGTTTG-3’）， GADPH-f（5’-GATTCCACCCATGGCAAATTCCA-3’）， GAP DH-r（5’-TGGTGATGGGATTTCCATTGAT GA-3’）。熒光定量PCR參照TaKaRa熒光定量PCR試劑（RR82LR）說明書進行。

1.6 Western blot實驗 細胞經RIPA裂解液裂解后，4℃，16 000×g離心30 min。利用12%的SDSPA GE膠分離蛋白質并轉移到PVDF膜上。用含有5%脫脂牛奶的PBS過夜封閉。一抗按照1∶1 000的比例稀釋，二抗按照1∶5 000的比例稀釋，經過顯色、曝光、壓片步驟后，檢測 HNF4α、GAPDH的含量。

A：細胞活性實驗（CCK-8）；B：細胞內HBV DNA相對含量（QPCR）；C：細胞外HBV DNA相對含量（QPCR）圖1 EGCG處理降低細胞內外HBV DNA的含量A： Cell viability was analyzed by CCK-8 Kit； B and C： In vivo and in vitro HBV DNA level was tested by QPCRFig.1 EGCG treatment significantly decrease HBV DNA amount both in vivo and in vitro

2 結果

2.1 EGCG顯著抑制HBV復制 首先研究EGCG對HepG2.2.15細胞復制的影響。如圖1 A所示，與對照組（DMSO）相比，經25μmol／L的 EGCG處理48 h后，細胞活力不受影響。實驗結果表明，25 μmol／L的 EGCG對 HepG2.2.15細胞沒有毒性。接下來研究EGCG對HBV復制的影響。如圖1B和1C所示，與對照組相比，EGCG處理HepG2.2.15細胞48 h后，細胞內外HBV DNA的含量顯著下降，表明EGCG顯著抑制HBV復制。

2.2 EGCG顯著下調HepG2.2.15細胞中HNF4a的含量 研究表明，在HBV復制的肝細胞中，轉錄因子 HNF4α表達上調并促進 HBV DNA復制［6］。考慮到EGCG可調控基因轉錄，且EGCG調控HNFs的研究尚未有報道，此次研究了EGCG對轉錄因子HNF4a的調控作用。如圖2 A和2B所示，分別利用熒光定量 PCR和 Western blot方法檢測了HepG2.2.15細胞中HNF4αmRNA和蛋白表達水平。研究發現，EGCG處理顯著降低HNF4α的表達，表明EGCG處理可顯著下調宿主細胞中HNF4α的表達。

2.3 沉默HNF4a編碼基因的表達導致EGCG抗HBV作用減弱 進一步研究了HNF4α在EGCG介導的抗HBV信號通路中的作用。利用siRNA沉默HNF4α的表達后，研究了HNF4a沉默表達對EGCG抗HBV作用的影響。如圖3 A和圖3B所示，沉默HNF4α的表達后，EGCG抗HBV復制作用顯著減弱，表明EGCG通過下調HNF4α的表達，抑制HBV復制。

A：利用熒光定量PCR方法檢測HNF4αmRNA相對含量；B：利用Western Blot檢測HNF4α的蛋白表達水平圖2 EGCG下調HepG2.2.15細胞中HNF4α的表達A：HNF4α mRNA expression was tested by QPCR；B：Western Blot was used to test HNF4α protein expressionFig.2 EGCG treatment down regulates HNF4αexpression in HepG2.2.15 cells

A：利用siRNA沉默HNF4a的表達；B：沉默HNF4α基因表達后，用熒光定量PCR方法檢測細胞內外HBV顆粒中DNA的含量圖3 沉默HNF4a基因表達后EGCG抗HBV作用顯著減弱A： HNF4α knock down was tested by western blot；B：HBV titers level was tested by QPCRFig.3 EGCG mediated anti-HBV role decreased significantly upon HNF4a knock down

3 討論

作為綠茶中含量最多的茶多酚，EGCG具有廣譜抗病毒作用。EGCG抑制HBV DNA復制作用，此前已經有大量文獻報道。比如，Xu等［4］以HepG2-N10為細胞模型，研究了EGCG的抗HBV作用。研究發現，EGCG處理可顯著抑制HBV的復制和轉錄并降低HBsAg和HBeAg的含量。亦有研究者發現，低濃度的EGCG 可抑制 HBV mRNA轉錄［3］，阻止HBV顆粒進入細胞［2］，或通過改變細胞微環境，阻止HBV復制［11］。然而，上述有關EGCG抗HBV作用的研究對象多集中病毒層面，很少涉及到EGCG對宿主細胞內在因子的影響。有研究發現，HCV非結構蛋白NS5A與HSC70相互作用，并招募HNF1α形成復合體結構，進而調控HNF1α的表達和以及HCV的復制［12］。在這一過程中HNF1a是促進HCV復制的關鍵細胞因子。考慮到EGCG同時具有抗 HCV作用［13］，且在乙肝細胞模型中，HNF1α與HNF4α協同作用，此次研究了HNF4α在EGCG抗HBV信號通路中的作用。

HNF4α是HNFs家族成員中唯一的促進HBV復制 的 轉 錄 因 子［6］。 Raney 等［14］研 究 發 現， 在HepG2.1細胞中過表達HNF4α，可使HBV preS1轉錄水平提高9倍。而Yu等［15］研究發現，在肝細胞HuH7中，過表達HNF4α則會增加pgRNA的表達至原來的14倍。這些研究顯示，HNF4α是細胞中重要的抗HBV因子。本研究利用HBV復制的細胞模型HepG2.2.15，研究了EGCG對HBV復制的影響。研究發現 EGCG可下調 HNF4α表達，并且抑制HBV DNA復制。利用siRNA沉默HNF4α的表達后，EGCG介導的抗 HBV作用幾乎消失，表明HNF4a是EGCG抗HBV信號通路中的重要細胞因子。 利用基因敲除實驗，Yu等［15］發現，HNF4α 可結合到HBV的基因組上，進而調控基因表達。其中HBV基因組上preS1和核心蛋白的兩個編碼區（nt1992-2435和 nt2830-3068）是 HNF4α的結合位點［16］。這一結果提示，EGCG介導的HNF4a的表達下調，可能會減少HNF4α與HBV基因組結合，進而降低HBV基因的轉錄，相關實驗正在開展中。值得注意的是，EGCG在細胞中穩定性是限制其成藥的一個重要的因素，因此科學工作者開發了大量的EGCG類似物以增加其穩定性［1］。這些EGCG類似物是否具有更好的抗HBV作用，未來值得探索。另外，考慮到EGCG的毒副作用較小，我們擬在接下來的工作中探索EGCG和核苷類藥物聯合用藥的可能性。

利益沖突 無