ELISA聯合NAT技術在獻血者血液篩查和輸血殘余風險分析中的應用

徐利強 李建華 倪修文 孫亞云 吳瑾惠 毛惠娜

314000嘉興市中心血站

輸血是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染途徑之一［1］。我國采供血機構現主要通過2種不同產家酶聯免疫（ELISA）試劑盒檢測獻血者血液HBsAg判斷是否存在HBV感染，有效降低了輸血HBV感染的發生率。但獻血人群中存在一定比例的窗口期（WP）感染和隱匿性感染（OBI）HBV感染者，其HBsAg檢測呈陰性，此部分血液輸血存在HBV感染風險［2-3］。核酸擴增檢測技術（NAT）是近年在獻血者血液篩查中開展的病毒核酸檢測方法［4］。本研究用ELISA聯合NAT技術對獻血者進行血液檢測，并對HBsAg-／HBV DNA＋進行HBV DNA定量和血清學分析，旨在探討屏蔽HBsAg-且NAT單反應樣本對預防經輸血傳播HBV的意義。

1 材料與方法

1.1 血標本來源 2015年1月至2015年12月嘉興市中心血站按 《獻血者健康檢查要求》（GB18467-2011）經 ALT、HB、HBsAg和 TP 聯合金標試劑條初篩合格，采集45 551份獻血者血液樣本，同步留取兩份血液樣本各5 ml（EDTA抗凝）。26 101份和19 450份來自男性和女性，年齡18～60歲。

1.2 OBI和WP確認標準 OBI確認需要滿足下面兩個條件：①血液標本血液篩查和補充鑒別試驗后確定病毒類型為HBsAg-／HBV DNA＋；②血液標本首次檢測出乙肝表面標志物或乙肝三系結果全陰，在追蹤回溯時其血清學乙肝表面標志物不發生明顯變化。WP確認需要滿足下面幾個條件：①血液標本血液篩查和補充鑒別試驗后確定病毒類型為HBsAg-／HBV DNA＋；②血液標本首次檢測乙肝三系血清學結果全陰，在追蹤回溯時其HBsAg轉陽，以及其他標志物也陸續出現。

1.3 HBsAg和HBV-DNA定性檢測 對初篩為HBsAg陰性的血標本采用2種不同的酶免疫試劑盒（北京萬泰、廈門新創、上海科華和意大利索靈生產）酶聯免疫法（ELISA）檢測HBsAg選出HBsAg-樣本。采用美國諾華檢測系統（Procleix Tigris）進行三聯熒光病毒單人份核酸擴增檢測技術（NAT）檢測，對有反應的標本再進行核酸鑒別試驗來檢測病毒類型，以確定HBV DNA是否為陽性（HBV DNA＋）。上述檢測獲得HBsAg-／HBV DNA＋樣本。

1.4 乙肝兩對半檢測 所有HBsAg-／HBV DNA＋樣本 ELISA檢測血清標志物抗-HBs（HBsAb）、HBeAg、抗-HBe（HBeAb）和抗-HBc（HBcAb）（試劑盒購自上海榮盛）。乙肝兩對半檢測結果均陰性的HBV DNA＋獻血者，多為HBV感染窗口期，進一步跟蹤隨訪確定結果。

1.5 HBV病毒載量測定 采用實時熒光-PCR（RT-PCR）進行 HBV DNA定量，檢測儀器為 ABI 7500實時熒光PCR儀，試劑盒購自廣州中山達安基因股份有限公司，檢測下限為20 IU／ml。按說明書提示提取研究對象的HBV DNA，選用北京康徹斯坦低值和高值為HBV室內質控品。PCR參數：93℃2 min；93 ℃ 45 s、55 ℃ 60 s，10 個循環；93 ℃ 30 s、55℃ 45 s，30個循環至反應結束。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件對數據進行統計分析處理，對分類變量資料采用用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OBI分布 45 551份獻血者樣本中，44份HBsAg-／HBV-DNA＋，其中3份乙肝兩對半檢測結果均為陰性，作窗口期處理，按窗口期進行跟蹤隨訪，隨訪結果2例出現血清學標志物轉，另1例血清學標志物幾乎無明顯變化，根據OBI和WP確認標準，確認OBI 42例，WP2例。42份獻血者確認OBI，檢出率為0.90‰，33例 OBI為男性 OBI檢出率1.26‰（33／26101），9 例女性 OBI檢出率 0.46‰（9／19 450）不同性別獻血人群OBI檢出率比較差異有統計學意義（χ2＝7.77，P ＜0.01）。 15例 OBI來自首次獻血者檢出率0.63‰（15／23 732），27例OBI來自重復獻血者檢出率1.24‰（27／21819），兩組比較差異有統計學意義（χ2＝4.59，0.01＜P＜0.05）。3組年齡組間比較差異有統計學意義（χ2＝20.91，P＜0.01），以41～60歲年齡組獻血者 OBI檢出率最高1.84‰，明顯高于其他組（χ2＝16.37和5.92，P＜0.05）為比例最高。 見表1。

表1 總獻血者篩查人數與隱匿性乙肝（OBI）人群一般資料的分布特征Tab.1 Distribution characteristics of the general data of screening for total blood donors and occult hepatitis B infection （OBI） population

2.2 HBsAg-／HBV-DNA＋樣本HBV DNA定量檢測結果 42份OBI樣本HBV DNA濃度范圍＜20～1.82 ×103IU／ml，中位數 32.6 IU／ml，HBV DNA 濃度＜20 IU／ml的 32份占 OBI樣本 76.2%，HBV DNA濃度范圍為20～100 IU／ml的8份占OBI樣本19.0%，另有2份 HBV DNA濃度 ＞100 IU／ml占OBI樣本4.8%。2份WP樣本HBV DNA分別為61.5 IU／ml和 24.1IU／ml。

表2 HBsAg-／HBV-DNA＋樣本血清學檢測結果Tab.2 HBsAg-／HBV-DNA ＋ sample serological test results

2.3 HBsAg-／HBV-DNA＋樣本血清學檢測結果見表2。44份NAT單反應陽性樣本中2份來自WP獻血者，42份來自OBI獻血者。OBI獻血者中5項血清學檢測指標全部陰性（模式-1）1份（2.3%）；模式-2除HBsAb陽性外，其余4項血清學指標陰性共2份（4.8%）；模式-3為指標HBcAb單項陽性共 4份占9.5%；模式-4為 HBeAb和HBcAb同時陽性共8份占19.0%；模式-5為HBsAb和HBcAb同時陽性共22份占52.4%（為本研究最常見血清學模式）；模式-6為 HBsAb、HBeAb和HBcAb同時陽性共5份占11.9%。5項血清學檢測結果HBcAb陽性最多39例占92.9%，其中30份（76.9%）HBV DNA 定量 ＜20 IU／ml（HBV DNA 確認陰性），9份（23.1%）HBV DNA定量≥20 IU／ml確認陽性。HBeAb和 HBcAb同時陽性13份占29.5%，其中11份（84.6%）HBV DNA定量 ＜20 IU ／ml。

3 討論

HBV感染呈全球流行，我國人群HBsAg攜帶率為7.18%，HBV感染的主要方式是通過血液傳播，因此對獻血者血液進行HBV篩查和HBV感染殘余風險檢測仍是保證輸血安全的重要環節［5］。文獻報道ELISA檢測血清HBsAg結果呈陰性導致獻血者存在HBV感染漏檢可能，常見的有OBI和WP兩種特殊的HBV感染狀態［2-3］。隨著核酸檢測技術的廣泛應用，《2015版血站技術操作規程》推薦用ELISA和NAT聯合檢測獻血者血液，具有更好的靈敏度的NAT用于獻血者血液篩查，旨在利用NAT提高低水平的HBV DNA的OBI人群的檢測效率。本研究用ELISA和NAT聯合檢測45 551份經過初篩的獻血者樣本，3份疑似WP按規定進行跟蹤隨訪，隨訪結果2例出現血清學標志物轉陽，另1例血清學標志物幾乎無明顯變化，最終確認分別有2份和42份為 WP和 OBI。OBI檢出率 1∶1 085（0.92‰）與中國臺灣1∶1 022 接近［6］，高于西安 1∶1 628［7］、大連 1∶2 293［8］、深圳 1∶3031 和亞洲東南亞地區的報道［9］，但低于福建 1∶569［10］、遠低于西非加納城市人口的1：67［11］。 與上述研究一致，不同性別、年齡和獻血次數與OBI檢出率的有統計學差異。本研究用的RT-PCR試劑盒檢測下限為20 IU／ml，結果42例 OBI獻血者血液中 32份 HBV DNA濃度＜20IU／ml、8份HBV DNA濃度范圍在20～100 IU／ml，而2份 WP血清 HBV DNA濃度分別是61.48 IU／ml和 24.10IU／ml，OBI和 WP 獻血者血液病毒載量都非常低，提示利用NAT技術可有效檢出獻血者血清中HBV-DNA，極大地降低了輸血感染 HBV 的風險［12］。

NAT技術應用HBsAg-獻血者血液HBV核酸檢測可有效降低輸血感染HBV的風險，主要原因有：①NAT為定性檢測有較高靈敏度，本研究用的RTPCR定量試劑盒檢測下限為20 IU／ml，結果30份OBI獻血者中HBV DNA定量＜20 IU／ml、8份HBV DNA濃度范圍在20～100 IU／ml，2份WP血清HBV DNA 濃度分別是61.48 IU／ml和24.10IU／ml，40 份低拷貝血液用定性NAT檢測HBV DNA均能有效檢出。②本研究中有1例疑似窗口獻血者跟蹤結果血清標志物沒有變化可能是OBI的S區基因突變導致“a”決定簇（124-147AA）和主要親水區（MHR，99-169AA）氨基酸的改變，影響HBsAg表達，以及感染者機體細胞免疫和體液免疫引起HBV囊膜蛋白改變，所有綜合效應導致機體對HBV處于免疫耐受狀態，核酸病毒低拷貝復制，免疫標志物蛋白不能正常表達和分泌，因此所有血清學指標均陰性，但NAT仍能有效檢出其病毒核酸。③我們檢測到2例HBsAb陽性而其余4項陰性樣本，提示這些獻血者機體通過天然免疫和適應性免疫應答的協調作用清除HBV病毒，但NAT陽性也表明OBI獻血者免疫功能受到抑制或免疫低下不能有效清除HBV，處于慢性感染狀態，此類獻血者血液中仍殘留病毒，存在輸血感染的可能性。④另外HBcAb是既往感染標志，可認為其為OBI血清學一種重要特征，有很好的指導價值。國外低流行區有利用HBcAb和HBsAb定量來綜合判斷血液的保留還是淘汰。我國在正常人群中HBcAb陽性率也接近50%，所以用HBcAb作為血篩一個指標勢必會誤淘汰部分獻血者會導致浪費血源。本研究OBI獻血者39份HBcAb陽性，且血清HBV DNA病毒載量多數小于20 IU／ml，而NAT仍能有效檢出。

綜上所述，無論HBV DNA定量是否高于檢測下限，NAT反應性標本均與HBV感染具有較高的相關性，ELISA和NAT聯合檢測比2種不同ELISA試劑盒檢測獻血者血液更能有效檢出獻血者血液中HBV，可進一步縮短病毒感染的窗口期，極大地降低了經血傳播疾病的殘余風險，保障了受血者輸血安全性。

利益沖突 無