遼寧絨山羊副結核分枝桿菌的分離鑒定及分子生物學檢測

宋先忱，李 冰，朱延旭，張興會，王世泉，郭 伶，徐 鵬，郭維軍，劉孝剛

(1遼寧省畜牧科學研究院，遼寧遼陽111000 ； 2.錦州醫科大學畜牧獸醫學院，遼寧錦州121001 ；3.錦州市動物疫病預防控制中心，遼寧錦州121002)

副結核病是由副結核分枝桿菌引起的一種慢性、消耗性傳染病，以頑固性腹瀉、逐漸消瘦、腸黏膜增厚為特征。主要感染牛、羊、鹿等反芻動物。該病1958年在地中海首次發現，同期我國內蒙古也發現了1例，隨后該病迅速蔓延至全國大部分地區[1-2]，給我國牛羊飼養業帶來了極大損失[3]。

遼寧南部地區某絨山羊養殖場，有少部分母羊產羔后陸續出現頑固性腹瀉、逐漸消瘦，后期食欲廢絕而衰竭死亡，剖檢發現回腸和結腸腸黏膜增厚、腸系膜淋巴結水腫、脾臟明顯萎縮等一系列臨床癥狀和剖檢病變，初步診斷為副結核病[3]，為了對本病進一步確診，同時為今后絨山羊副結核病的診斷與防控工作提供科學依據，開展了本項試驗工作。

1 材料與方法

1.1 病原分離鑒定

1.1.1 材料 病料來源，遼寧南部地區某絨山羊養殖場疑似副結核病羊1只，剖檢后無菌操作采取心、肺、肝、脾、腎、腸系膜淋巴結及腸道內容物。

Dubods油酸瓊脂培養基，購自招遠拓普生物工程有限公司；石炭酸復紅溶液、3%鹽酸酒精(脫色劑)、堿性美藍復染(復染液)均由本校微生物實驗室提供。

1.1.2 方法 將心、肺、肝、脾、腎、腸系膜淋巴結6個部位的病料先用4%H2SO4處理30 min，經中和后再無菌操作接種到Dubods油酸瓊脂培養基上，腸內容物及黏膜用刀片刮取，放入40 mL、0.75%HPC(氯化十六烷基吡啶)塑料管中，于室溫下豎立48 h后以去污染物，再用滴管吸取沉淀物上層液體，接種于培養基中。

在37 ℃條件下培養9～13周，詳細觀察菌株生長情況，前8周每2周觀察1次，后5周每2 d觀察1次。出現疑似菌落樣品，挑取單個菌落，進行抗酸染色鏡檢，觀察是否符合副結核分支桿菌的形態特征。

2 分離菌的PCR檢測

2.1 材料 DL-2 000 Marker，購自上海生工生物工程技術服務有限公司；2×TaqMaster Mix(含染料)，購自北京全式金生物科技有限公司；核酸染料；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自北京天根生物工程技術有限公司；小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

2.2 方法

2.2.1 引物的設計 選擇王素華[4]設計的副結核分枝桿菌特性引物，預期產物246 bp，引物由(上海)生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列見表1。

表1 特異性引物相關信息

2.2.2 細菌基因組DNA提取 按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書介紹的方法提取基因組。提取的基因組，置于-20 ℃冰箱保存備用。

2.2.3 PCR擴增 94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環，72 ℃終延伸5 min，最終4 ℃保存。PCR反應體系30 μL：模板3 μL、2×TaqMaster Mix 15 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 10 μL。

2.2.4 PCR產物電泳：PCR擴增后經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，取5 μL DNA Marker和5 μL PCR擴增產物加到樣品孔，在1xTAE電泳緩沖液中，120 V 電壓電泳30 min，在凝膠系統中觀察結果。

2.2.5 PCR產物序列測定與分析：將PCR 產物膠回收，委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，并將結果與GenBank中的基因序列進行比較分析。

3 結果

3.1 病原分離鑒定結果 經過9～13周培養后，在接種肝臟病料的培養基上長出乳白色、光滑、邊緣整齊的菌落，見中插彩版圖1，在接種心、肺、脾、腎、腸系膜淋巴結及腸內容物的6個培養基上沒有長出上述形態的菌落，只有一些雜菌生長。挑取疑似單個菌落進行抗酸染色鏡檢后，可見不規則(單個、成叢)的紅色短小桿菌，見中插彩版圖2。

3.2 PCR檢測結果 提取DNA基因組，對所分離出來的疑似羊副結核分支桿菌進行PCR擴增，PCR產物上樣量每孔5 μL，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以DL-2 000 Plus DNA Marker為標準，可見在246 bp左右有明顯的目的條帶，與預期的目的條帶大小一致，見圖3。

3.3 測序分析結果 目的基因擴增產物測序結果為246 bp，見圖4。通過BLAST在線比對，同源性在95%以上的有16株，其中與JⅡ-1961(CP022105.1)菌株同源性達100%，進一步證實了分離菌株為副結核分支桿菌。

圖3 羊副結核分支桿菌PCR鑒定結果注：M∶DL-2 000 Plus DNA Marker ； 1：分離菌株 ； 2：陰性對照

圖4目的基因擴增產物測序結果

4 討論

副結核分枝桿菌主要從感染患病動物的糞便或內臟組織中分離獲得，由于副結核病潛伏期長以及副結核分枝桿菌對培養基要求條件苛刻，造成該病原體初代分離非常困難，一般需要6～8周的時間才能生長出肉眼可見的菌落，長者可達6個月[5]。所以國內關于該病的病原分離鑒定方面的研究報道很少，吳建勇等[6]采集新疆地區發病奶牛的糞便病料，在HEYM培養基上經過8～12周時間成功培養出副結核分枝桿菌，并經PCR檢測和基因序列比對分析證實新疆地區規模化奶牛場中存在副結核分枝桿菌感染。

本試驗采集遼寧地區發病絨山羊的內臟組織和腸內容物病料，在Dubods油酸瓊脂培養基上經過37 ℃、9～13周時間培養，經抗酸染色鏡檢結果表明，從發病羊的肝臟組織中成功分離出一株副結核分枝桿菌，并經PCR檢測和基因序列比對分析進一步證實了分離菌即為副結核分枝桿菌。從而首次證實遼寧地區絨山羊飼養場中存在副結核分枝桿菌感染。

副結核分枝桿菌主要存在于感染患病動物的糞便或內臟組織中，本研究在同一只發病羊的肝臟中分離出副結核分枝桿菌，而在心、肺、脾、腎、腸系膜淋巴結及腸內容物6種病料組織中沒有分離出副結核分枝桿菌，分析其中原因，可能與不同發病時期各內臟組織中的帶菌量有關，具體原因還有待于進一步研究探討。

關于副結核分枝桿菌的培養時間，各種文獻說法不一，有6～8周或6個月[7]、5～14周[2]、8～12周[6]等，本試驗為9～13周。筆者認為培養時間不存在絕對性，主要與使用的培養基成分和培養基的pH值有關，目前使用的培養基均不夠理想，建議應加強副結核分枝桿菌培養基篩選和優化方面的研究，應該有很大的提升空間。

遼寧省是遼寧絨山羊的主產區，飼養規模已超過300萬只，最新血清學調查結果顯示，遼寧絨山羊主產區副結核病的感染率已超過10%，本試驗進一步證實了遼寧地區絨山羊飼養場中副結核病的存在，建議相關部門應重視絨山羊副結核病的防控工作，保障遼寧絨山羊飼養業的健康發展。