犬臍帶間充質干細胞抗關節炎炎癥反應的研究

張貝瑩，王丙云，羅冬章，詹小舒，陳勝鋒，陳志勝，計慧琴，白銀山

(佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東佛山528231)

骨關節炎(Osteoarthritis，OA)是犬最常見的關節病之一。近年來該病呈持續增加的趨勢，對寵物犬的健康與福利造成了嚴重的損害，引起了全世界獸醫界的關注。骨關節炎實際上并非簡單的炎癥，而是一種由多種因素導致，以關節軟骨的變性、破壞與骨質增生為特征的慢性關節病。相關研究表明，大量OA患者存在滑膜炎，且患者關節的炎癥和OA的進展有直接關系，促炎細胞因子、活性氧(ROS)、一氧化氮、基質降解酶和生物力學應激是導致OA形成的主要因素[1]。大量炎癥細胞因子參與了軟骨新陳代謝活動，可在相互作用下，對軟骨細胞造成破壞，如白細胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、血管內皮細胞因子(VEGF)等[2-3]。

由于目前缺乏有效治療OA的方法，因此更好地了解OA中的炎性病理生理學，可在OA早期識別其慢性低度炎癥從而改善患者炎癥和疼痛的等癥狀，同時有助于發現有效減少關節破壞性變化并預防永久性功能障礙的新方法[4]。目前基于細胞治療的新型OA療法已成為新興的研究和開發領域，間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可促進組織的修復或再生，具有抗炎的潛能[5]。其中，臍帶來源的間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs)具有獲取容易、擴增能力強、歸巢性良好、免疫原性低、分化為軟骨細胞的潛能和無致瘤性等諸多優點，具有巨大的應用前景[6]。

本試驗通過手術打磨膝關節軟骨建立犬關節炎模型，將異體UC-MSCs懸液注入試驗犬膝關節腔內，通過測定試驗犬的體溫、血常規與生化指標以及炎性因子等指標，對比研究UC-MSCs對犬膝關節炎的抗炎效果，為探討一種安全、經濟、簡便并易于向臨床推廣的治療關節炎的細胞療法提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 5-6月齡健康中華田園犬8只(體重約7 kg/只、雌雄各半)，隨機分為模型組和治療組，每組4只。

1.2 主要試劑 臍帶間充質干細胞完全培養基(Cyagen公司)；IL-6、IL-7和TNF-α酶聯免疫檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；ALP、TP、ALB、BUN、CREA、Pi和Ca2+檢測試劑盒(上海科華生物工程股份有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 犬UC-MSCs的制備 取犬的臍帶華通膠，0.1%Ⅰ型膠原酶消化分離獲得UC-MSCs后，過濾、離心，重懸細胞后移至35 mm培養皿中，置37 ℃、5%CO2培養箱，培養2 d后PBS洗滌換液。待細胞鋪滿細胞培養板80%～90%時，0.25%胰酶消化進行傳代培養，取第3代UC-MSCs作為治療細胞。

1.3.2 犬OA模型的建立 試驗犬采用丙泊酚及異氟烷配合麻醉，取犬左側后肢膝關節在無菌條件下進行手術。打開膝關節通路，暴露滑車關節面，將髕骨推出膝關節，使用關節打磨鉆，高速檔、夾持刷鉆鉆頭對膝關節軟骨面進行打磨，直至將滑車脊和滑車槽軟骨面全部打磨掉為止，然后縫合膝關節，并調整好髕骨位置。

1.3.3 UC-MSCs注射治療OA方法 患肢膝關節局部剪毛消毒，采用關節腔內注射UC-MSCs治療方法。將針頭沿髕骨下緣刺入皮膚，借助B超觀察患犬膝關節外側，當針尖到達低回聲區域(含關節液的關節腔)時，將1 mL注射液注入關節腔。即術后第1天和第3天模型組每只犬注射1 mL生理鹽水，治療組每只犬注射1 mL含1×106個UC-MSCs的細胞懸液。

實驗犬術后7 d內正常使用抗菌消炎和鎮痛藥物(氨芐西林1.5 mL/只4 d，頭孢1.5 mL/只3 d)，每天對傷口進行清潔消毒。

1.3.4 采血 干細胞治療后第3、7、14、28天時在每只實驗犬后肢外側小隱靜脈或前肢內側頭靜脈采血5 mL，置于抗凝管。取1 mL血液按全國臨床檢驗操作規程(第四版)進行血常規檢測；取4 mL血液 2 500 r/min離心10 min制備血漿，-80 ℃超低溫保存備用。用試劑盒檢測犬血液中ALP、TP、ALB、BUN、CREA、Pi、Ca2+等血生化指標，測定方法按照說明書進行；用ELISA試劑盒檢測犬血液中IL-6、IL-7和TNF-α三種炎性因子。

2 結果

2.1 飲食及運動情況 手術造模后，實驗犬的左側后肢疼痛腫脹、跛行，但飲食正常、精神狀況良好，傷口恢復良好。

2.2 體溫變化情況 實驗犬治療后，模型組體溫迅速升高并持續在39 ℃以上，治療后10 d內體溫平均值高于治療組體溫平均值，第3周模型組體溫小幅度上升后恢復正常；治療組體溫于治療后體溫均低于39 ℃，在第11天有小幅度升高，持續3 d后恢復正常(見圖1)；其中治療后5 d時模型組犬的體溫極顯著高于治療組(P<0.01)；治療后6 d和10 d時模型組與治療組實驗犬體溫有顯著性差異(P<0.05)(見圖1和表1)。

2.3 血常規檢測結果 由表2可見：(1)UC-MSCs能抑制WBC的滲出和嗜中性粒細胞的產生：模型組的實驗犬WBC和嗜中性粒細胞的數量在治療3 d后平均值分別為21.66×109/L和11.91×109/L，均高于正常范圍，而治療組的WBC和嗜中性粒細胞數值均在正常范圍內，模型組和治療組的WBC數量有極顯著差異(P<0.01)；治療14 d后，模型組的嗜中性粒細胞顯著高于治療組(P<0.05)；模型組的淋巴細胞在治療3 d時開始低于治療組，直至28 d時有顯著性差異；兩組的淋巴細胞百分比值在造模治療后均增加，但模型組的淋巴細胞百分比值低于治療組，在3 d時有顯著差異(P<0.05)；模型組的嗜酸性粒細胞及其百分比在治療3 d時顯著低于治療組(P<0.05)。

圖1試驗犬體溫變化

表1 試驗犬經UC-MSCs治療后體溫的變化 ℃)

*：組間差異顯著；**：組間差異極顯著。下表同

檢測指標單位組別治療3 d治療7 d治療14 d治療28 d白細胞數 109/L模型組治療組21.66±2.8412.35±2.77**9.17±3.6410.12±1.4512.67±1.8711.83±1.149.99±0.459.78±2.52嗜中性粒細胞數109/L模型組治療組11.91±5.024.46±1.39*2.89±1.602.81±0.535.06±1.083.54±0.45*3.41±0.344.02±1.58嗜酸性粒細胞數109/L模型組治療組0.03±0.020.02±0.010.01±0.010.03±0.02*0.10±0.160.07±0.080.02±0.010.03±0.03淋巴細胞數109/L模型組治療組2.91±0.653.47±0.773.43±0.734.28±0.284.61±0.994.36±0.953.21±0.123.71±0.31*嗜酸性粒細胞百分比(Eos% )%模型組治療組0.13±0.100.10±0.080.05±0.060.30±0.14*0.90±1.530.53±0.600.15±0.060.35±0.26淋巴細胞百分比(%) %模型組治療組13.98±5.4028.90±8.79*40.35±11.1443.00±6.9336.18±2.9436.68±5.1332.15±1.7539.30±8.23紅細胞數 1012/L模型組治療組5.42±0.065.42±0.384.68±0.395.42±0.36*5.27±0.155.72±0.555.53±0.335.17±0.58血紅蛋白g/dL模型組治療組112.00±3.56117.00±8.1696.50±8.35116.50±5.20**109.00±1.41119.00±12.30115.25±5.56114.50±9.95平均紅細胞血紅蛋白含量 pg模型組治療組20.68±0.6321.58±0.4320.63±0.5021.53±0.46*20.68±0.3420.80±0.5620.85±0.3122.23±0.63**平均紅細胞血紅蛋白濃度 g/L模型組治療組315.00±6.98326.00±0.82*319.25±13.40325.50±4.12317.75±4.65314.75±7.04317.50±1.29327.50±2.89**紅細胞分布寬度變異系數%模型組治療組15.50±1.1515.55±0.1915.75±1.5915.43±0.1715.45±1.0715.18±0.4216.20±0.8115.93±0.33血小板數目(PLT)109/L模型組治療組26.00±18.0271.25±61.9244.75±52.2058.50±14.6249.00±12.52150.50±65.96*269.50±258.7187.50±55.08血小板壓積(PCT)%模型組治療組0.03±0.020.08±0.080.05±0.060.07±0.020.05±0.010.15±0.05**0.21±0.190.09±0.07

(2)UC-MSCs促進機體淋巴細胞、RBC的產生：治療3 d后，模型組的平均紅細胞血紅蛋白濃度顯著低于治療組(P<0.05)，且在治療28 d后有極顯著差異(P<0.01)；治療7 d后，模型組的RBC、MCH、HCT顯著低于治療組(P<0.05)，且模型組的HGB極顯著低于治療組(P<0.01)，治療28 d后，模型組的MCH和MCHC均極顯著地低于治療組(P<0.01)。

(3)UC-MSCs促進PLT的產生：治療14 d后，模型組犬的PLT顯著低于治療組(P<0.05)，PCT極顯著低于治療組(P<0.01)。

(4)其余檢測指標情況：模型組的嗜中性粒細胞百分比(Neu%)高于治療組，平均紅細胞體積(MCV)則低于治療組；模型組的平均血小板體積(MPV)低于治療組而血小板分布寬度(PDW)高于治療組；但與嗜堿性粒細胞數(Bas#)、單核細胞數(Mon#)、嗜堿性粒細胞百分比(Bas%)、單核細胞百分比(Mon%)、紅細胞分布寬度變異系數(RDW-CV)、紅細胞分布寬度標準差(RDW-SD)等指標一樣，兩組間對比無顯著差異。

2.4 血生化指標檢測結果 由表3可見，在治療7 d時治療組的ALP極顯著低于模型組(P<0.01)，其他血生化指標無顯著差異。

檢測指標單位組別治療3 d治療7 d治療14 d治療28 d堿性磷酸酶U/L模型組治療組154.00±43.00108.50±9.26116.00±5.0091.00±6.05**101.00±20.00102.75±8.8599.00±14.0097.5±17.29總蛋白g/L模型組治療組52.00±3.0052.68±2.5451.00±3.0050.48±0.4047.00±3.0046.68±0.5146.00±2.0045.00±4.50球蛋白g/L模型組治療組23.00±2.0022.93±1.0721.00±3.0022.20±1.2221.00±2.0022.03±0.9123.00±1.0022.18±1.37白蛋白g/L模型組治療組29.00±2.0029.75±1.9230.00±3.0028.28±1.0226.00±4.0024.65±0.9124.00±2.0022.83±3.13尿素氮mmol/L模型組治療組6.00±1.005.65±1.006.00±3.007.98±0.746.00±1.006.87±0.676.00±1.006.53±1.25肌酐μmol/L模型組治療組47.00±1.0046.68±4.5748.00±8.0049.75±8.1844.00±3.0048.60±7.3748.00±4.0048.88±4.70磷mmol/L模型組治療組2.00±02.31±0.042.00±02.39±0.022.00±02.16±0.062.00±02.23±0.13鈣mmol/L模型組治療組3.00±03.18±0.063.00±03.21±0.063.00±02.90±0.043.00±02.95±0.16

2.5 炎性因子檢測結果 由表3可見，治療3 d和28 d時，模型組和治療組的IL-6、IL-7和TNF-α無明顯差異；治療7 d時，模型組的IL-6和TNF-α均顯著高于治療組(P<0.05)；治療14 d時，模型組與治療組的IL-6有極顯著差異(P<0.01)，同時IL-7和TNF-α均有顯著差異(P<0.05)。

檢測指標單位組別治療3 d治療7 d治療14 d治療28 d白介素-6(IL-6)pg/mL模型組治療組55.25±14.1848.95±4.7357.42±7.8840.29±6.56*56.76±4.0145.24±4.62**57.02±7.7554.14±5.35白介素-7(IL-7)pg/mL模型組治療組18.71±6.4716.39±2.2020.17±5.3213.34±1.9021.03±4.6713.66±3.03*22.23±3.4818.62±2.66腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ng/L模型組治療組107.95±29.9891.32±8.08112.02±20.2772.15±24.10*108.97±9.9966.99±26.38*107.58±5.7185.15±25.07

3 討論

目前的研究發現，OA的病理機制十分復雜，其中，炎癥介質由軟骨、骨和滑膜釋放，低度炎癥由代謝引起，先天性免疫和炎癥反應促使OA的形成[7]。最近的研究發現，疾病初期的炎癥機制主要是由于對關節機械刺激引起的損傷，細胞因子如IL-1，IL-4，IL-9，IL-13和TNF-α的釋放等原因可觸發OA的形成[8-9]。此外，炎癥在OA的疾病中的作用已通過關節積液與關節疼痛的關聯來識別，但是什么程度的炎癥反應會引起關節損傷尚不清楚[4]。

針對這一疾病特點，許多研究發現，MSC能通過分泌抗炎細胞因子和生長因子減緩OA的惡化，減輕OA的炎癥反應和患者的疼痛。MSC來源于中胚層，具有自我更新和多向分化潛能，可從多種組織器官(如骨髓、脂肪、胎盤和臍帶)中分離獲得。并具有歸巢性，能遷移到身體損傷部位分化成各種細胞系，如骨、脂肪、軟骨、肌肉和骨骼等[10-11]。而臍帶MSC因具有易于獲取、免疫原性低、無倫理性爭議等優勢被廣泛應用于再生醫學當中[12-13]。

本試驗通過對OA模型進行對比治療，對比體溫結果發現，注射UC-MSCs的治療組實驗犬的體溫在前11 d均低于模型組，說明UC-MSCs能減輕機體發熱；血常規檢測指標結果發現，治療組的WBC和嗜中性粒細胞的數量于治療OA模型3 d時顯著低于模型組，而治療組的RBC、HGB和HCT在7 d時顯著高于模型組，說明UC-MSCs能有效抑制炎癥細胞產生，促進淋巴細胞和RBC的生成；PLT在治療14 d時顯著高于模型組，此外，治療組的MPV高于模型組，PDW則低于模型組但無顯著性差異，說明UC-MSCs可能有助于PLT更集中于損傷處；血生化指標結果發現，在治療7 d時治療組的ALP極顯著低于模型組而其他指標無差異，臨床上測定ALP主要用于骨骼、肝膽系統疾病的診斷和鑒別診斷，治療組的ALP水平低于模型組，說明UC-MSCs對OA的修復有促進作用，而ALP亦有助于OA的檢測診斷。治療組的炎性因子IL-6、IL-7和TNF-α的水平在7～14 d顯著降低，但在3 d和28 d時，治療組的炎性因子水平與模型組無顯著差異，說明在OA模型早期，實驗犬體內的炎性因子無顯著差異，但在7～14 d時，UC-MSCs能抑制炎性因子的產生，但抑制作用會隨著時間而降低；這些結果說明，UC-MSCs對關節炎的炎癥反應具有顯著的抑制作用，其機制可能是通過抑制白細胞和嗜中性粒細胞的產生來減輕機體發熱和炎癥反應，并通過抑制炎性因子的產生來減緩炎癥反應，同時通過促進機體淋巴細胞和紅細胞的產生來增強機體免疫能力和抗感染的能力，并通過增加血小板的產生促進血液凝固和傷口愈合。