豬流行性腹瀉病毒貴州株M全基因遺傳變異分析

田 琴,柳曉飛,張雙翔,胡興義,張 羽,田祥強,潘 永,楊蘭蘭,王開功,周碧君,文 明,程振濤

(1.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽550025 ； 2. 貴州省動物疫病研究室，貴州貴陽550025 ;3.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州貴陽550001)

豬流行性腹瀉病(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的接觸性腸道傳染病，各日齡的豬群均能感染，主要臨床癥狀表現為嚴重腹瀉、嘔吐、脫水，其中對哺乳仔豬危害最為嚴重。1978年英國首次報道PED后[1]，中國于1980年首次報道該病，隨后各省均有PEDV感染報道。2010年后，豬流行性腹瀉在全球各國均發生大面積的流行[2-3]。我國也不例外，從南到北出現全面暴發，特別是2013年以來，該病給我國養豬業造成了巨大經濟損失。

PEDV屬單股正鏈RNA病毒，基因組全長約28 kb，編碼4種結構蛋白和3種非結構蛋白。其中，S基因編碼病毒纖突蛋白，該蛋白具有識別靶細胞可使病毒和細胞膜融合的作用，其在免疫反應中起重要作用，因此分析當地PEDV毒株的流行和遺傳變異情況具有重要價值[4]。M基因編碼的結構蛋白是一種跨膜蛋白，在病毒組裝和出芽過程中起重要作用，保守性強，是作為檢測PEDV的重要靶基因，在PEDV侵染的早期可妨礙宿主細胞基因的轉錄[5]。

目前，貴州省對PEDV的研究還側重于病原調查、抗體水平檢測等方面。對PEDV分子研究尚少，本試驗對貴州省當前PEDV流行毒株的M全基因進行基因克隆和序列分析，為預防和控制PEDV提供有力的科學數據。

1 材料與方法

1.1 陽性樣本來源 2017年6月貴州省福泉某規模化養豬場，1～8日齡仔豬出現嚴重腹瀉、脫水和消瘦，采集腸道及內容物進行病原學檢測。

1.2 主要試劑 RNA及DNA提取試劑盒，購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司；Prime ScriptTMRTMaster Mix,購自TaKaRa公司；E.Z.N.A.TMGelExtraction Kit膠回收試劑盒。

1.3 引物設計與合成 根據GenBank收錄的PEDV M基因(登錄號：AF-353511)設計一對特異性引物，上游引物：5′-TACATGCGAATTGACCCCCT-3′，下游引物：5′-ATCCTTGTTA GTGGGTACACCG-3′，大小為681 bp，并送上海英駿生物技術有限公司合成。

1.4 樣本處理及核酸提取 將收集的腸道和內容物用其滅菌PBS進行研磨，-80 ℃凍融3次，離心取200 μL上清液加入1.5 mL離心管中，加入800 μL TRIZol，充分混勻并讓其靜置10 min，再加入200 μL氯仿，混勻靜置10 min，12 000 r/min離心 8 min，取上清移入2.0 mL吸附柱套中，12 000 r/min 離心1 min，棄掉收集管中液體，加入400 μL RinseA 12 000 r/min離心 1 min，棄掉收集管中液體，加入700 μL RinseB 12 000 r/min離心 1 min(重復1次)，空柱離心1 min，吸附柱移入1.5 mL離心管中，加入25 μL DEPC處理水，讓其靜置2 min，12 000 r/min離心 1 min，1.5 mL離心管中液體即為總RNA模板。

1.5 反轉錄及PEDV M全基因擴增 反轉錄體系：2 μL Prime Script1step Enzyme Mix，2 μL RNA，6 μL RNase Freed H2O，其條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。PCR擴增體系：cDNA 2.0 μL，2×TaqMix 12.5 μL，上游引物(10mol/L)1.0 μL，下游引物(10mol/L)1.0 μL，滅菌ddH2O 8.5 μL補至25 μL，其條件：94 ℃ 3 min，然后94 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35 個循環，72 ℃ 7 min。

1.6 PEDV M基因克隆、測序和遺傳進化樹分析 將RT- PCR擴增產物經膠回收純化后，與載體pMD19-T連接過夜，轉化DH5-α感受態細胞，取陽性菌液送至英濰捷基(上海)貿易有限公司進行測序。利用DNAStar中的MegAlign對2株PEDV貴州流行毒株及國內外登錄的26株參考毒株的M全基因進行遺傳進化樹和同源性分析。

2 結果與分析

2.1 PEDV M全基因RT- PCR擴增結果 將其擴增產物取8 μL上樣于1.2%瓊脂糖凝膠電泳，可見大小為681 bp的特異性擴增片段，與預期結果一致(圖1)。

圖1 PEDV M全基因RT- PCR擴增結果

M:DL-2 000 Marker; 1-2:PEDV M全基因RT- PCR產物；

-:陰性對照

2.2 PEDV M全基因測序結果 經克隆為陽性的菌液送至英濰捷基(上海)貿易有限公司進行測序拼接，為了便于分析測序結果與GenBank公布的不同地方26株PEDV流行毒株對比，證實獲得了2株PEDV M全基因序列，將其命名為GZFQ06-2017，M基因全長為681 bp，編碼226個氨基酸。

2.3 PEDV M全基因的核苷酸序列的同源性分析 利用DNAStar軟件對PEDV M全基因的核苷酸和氨基酸序列進行同源性分析。由表1可知，GZFQ06-2017 PEDV M基因與GenBank 公布的26株參考序列(除韓國毒株SM98)的核苷酸相似性為94.0%～95.2%，與中國福建CH/FJZZ-9/201毒株和中國海南CH/HNQX-3/14毒株核苷酸相似性最低，為94.0%，與中國江蘇SQ2014毒株核苷酸相似性最高，為95.2%。表明貴州省2017年6月GZFQ06-2017毒株與過去的分離毒株存在突變。

表1PEDVM全基因核苷酸序列同源性比較

2.4 PEDV M全基因遺傳進化樹分析 應用MegAlign等軟件對測序序列與參考序列進行系統進化樹繪制，系統進化樹構建結果(見圖2)。GZFQ06-2017為本試驗經克隆得到的序列，從遺傳進化樹可以看出，除韓國毒株SM98外，2017年6月貴州省PEDV流行毒株GZFQ06-2017與韓國疫苗株Attenuated DR13、中國江蘇SQ2014、中國四川SC1402毒株和中國新疆CH/S在同一分支上，其親緣關系較近；與中國湖北CH-hubei-2016、中國云南CH/YNKM-8/2013親緣關系較遠；而經典毒株CV777與1986年中國新疆CH/S毒株在同一分支上。可以推測貴州的PEDV流行毒株M全基因與過往或者其他國家(或地區)相比出現一定的變異，但是仍然與經典毒株CV777、韓國疫苗株Attenuated DR13、中國江蘇SQ2014、中國四川SC1402和1986年中國新疆CH/S分支相距將近，推導親緣關系較近。

3 討論

PEDV是20世紀70年代報道以來，是導致豬病毒性腹瀉的最主要的病原之一，感染后仔豬表現嚴重嘔吐、水樣腹瀉和脫水直至死亡等臨床癥狀，該病毒的體外繁殖一直困擾著該病的深入研究[6]。過去，研究人員采用多種方法試圖使病毒適于細胞培養，先后以PK-15細胞、BHK細胞和人肺細胞等進行相關試驗，但均沒有成功，直到1988年 Hofmann 等在培養液中加入胰酶，使PEDV成功地適應于Vero傳代細胞[7]。貴州省2010冬季以來受到豬病毒性腹瀉的肆虐，其中，PED每年冬春季節發病率和病死率都在逐年增加，因此該病的流行一直受到人們的廣泛關注。

圖2PEDVM全基因核苷酸系統進化樹分析

雖然PEDV只有一種血清型，但是分子生物學的分析結果表明，PEDV的基因組存在基因多樣性[8]。其中，PEDV M基因全長681 bp，編碼226個氨基酸，構成病毒的表面結構蛋白，分子量為27 kDa～32 kDa，是一種跨膜糖蛋白。M蛋白無信號肽，預測具有3個跨膜區域，包含兩個RNA結合結構域，分別位于病毒外面的氨基末端結構域和病毒內部的羧基結構域，且保守性相對較高。有研究表明，M蛋白可以與M蛋白自身、N蛋白和S蛋白相互作用，在病毒組裝過程中發揮重要作用。據報道，同屬于冠狀病毒科的SARS病毒其M蛋白具有干擾素拮抗活性。因此M蛋白常被研究者作為檢測PEDV引物設計的首選，同時M蛋白可以作為PEDV基因工程疫苗的候選抗原[9]。

本研究利用RT -PCR成功檢測到2017年6月貴州省福泉某規模化養豬場8日齡左右的哺乳仔豬僅存在PEDV感染，對其中2份陽性樣品的PEDV M基因進行克隆和序列比對，結果發現，2株PEDV貴州流行毒株M基因與GenBank上公布的26株PEDV M 基因序列進行比對，GZFQ06-2017 PEDV M基因與參考序列(除韓國毒株SM98)的核苷酸相似性為94.0%～95.2%，與中國福建CH/FJZZ-9/201毒株和海南CH/HNQX-3/14毒株核苷酸相似性最低，為94.0%；與中國江蘇SQ2014毒株核苷酸相似性最高，達95.2%。推測貴州省2017年6月GZFQ06-2017毒株與過去的分離毒株存在較大的基因突變。 M基因系統發育樹分析結果表明，GZFQ06-2017 PEDV流行毒株與韓國疫苗株Attenuated DR13、中國江蘇SQ2014和中國四川SC1402毒株分支相距較近，而與經典毒株CV777與1986年中國新疆CH/S毒株在分支相近，得出其親緣關系較近；與中國湖北CH-hubei-2016和中國云南CH/YNKM- 8/2013親緣關系較遠。可以推導目前貴州的PEDV GZFQ06-2017 M全基因與過往其他國家(或地區)相比出現較大的差異。說明近年來貴州省不同地區的PEDV流行毒株的M基因變異性大，這與過去的研究結果類似。