江陰市HIV-1感染者亞型及原發耐藥基因突變研究

陳孫云 郭春輝 吳楠楠 王蓓 鄧國炯

214400江陰，東南大學附屬江陰醫院（陳孫云、郭春輝、鄧國炯）；210009南京，東南大學公共衛生學院（吳楠楠、王蓓）

高效抗逆轉錄病毒治療（HAART）能有效降低艾滋病病毒（HIV）感染相關的疾病的患病率和死亡率，極大降低了HIV的感染率，提高了HIV感染者的生活質量［1-3］，而HIV的易突變特性加之抗病毒治療藥物的選擇壓力最終導致了耐藥的發生，嚴重影響著HIV感染者抗病毒治療的效果以及生存問題，受到了全球公共衛生領域的極大關注。目前在我國對于HIV-1感染者在感染后／治療前都未進行耐藥基因的檢測，因此對新發感染者耐藥位點的早期監測，及時調整患者治療方案，對減少耐藥產生及提高抗病毒治療效果意義重大。為進一步了解江陰市2013—2015年常住人口中新發HIV-1感染者亞型分布及原發耐藥基因變異情況，現對該人群進行耐藥性檢測與分型，以更清楚地了解當地HIV-1亞型流行及耐藥突變狀況，為HIV-1感染者的耐藥檢測和后續治療提供依據。

1 研究對象與方法

表1 HIV-1 pol基因擴增引物序列Tab.1 Primer sequences and fragments length of HIV-1 pol

1.1 樣本來源 選取江蘇省江陰市疾病預防控制中心2013—2015年確認和管理的111例新發HIV-1感染者為研究對象，研究對象均為當地常住人口。在取得研究對象的知情同意的情況下，開展流行病學調查研究，并進行2～4年隨訪調查。采集患者外周靜脈血，在6 h內進行血漿、血細胞的分離后置于-80℃冷藏備用。

1.2 核酸提取與基因擴增 用QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen公司）試劑盒從外周血單個核細胞中提取前病毒DNA，使用TaKaRa Ex TaqTMHot Start Version試劑對HIV-1的pol區基因進行巢式PCR法擴增。反應條件為：第1輪 98℃ 3 min；98℃30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 個循環；72 ℃5 min。 第2輪 98 ℃ 3 min；98 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72℃ 1 min，35個循環；72℃ 5 min。反應體系為：H2O 34.5 μmol／L，10 × Ex Taq Buffer 5 μmol／L，dNTP Mixture（2.5 mmol／L）4 μmol／L，上下引物（20 μmol／L）各 0.5 μmol／L，Ex Taq HS0.5 μmol／L。 引物序列見表1。以第一輪擴增產物為模板進行第二輪擴增。擴增陽性產物經1%瓊脂糖凝膠凝膠電泳鑒定無誤后，送至上海生物工程有限公司進行測序，測序引物為第二輪擴增引物。

1.3 序列分析 對測序公司返回的序列通過Contig Express進行拼接與堿基的校正，使用BioEdit 7.0軟件生成“fasta文件”數據庫并提交至 https：／／www.hiv.lanl.gov／content／sequence／BASIC＿BLAST／basic＿blast.html中的HIV BLAST程序，進行快速分型并下載相似度最高的序列作為參考序列。使用Mega 6.06構建系統進化樹（Phylogenetic tree），確定樣本分型。再將序列提交至斯坦福大學HIV耐藥 數 據 庫 （ http：／／hivdb.stanford.edu／pages／algs／sierra＿sequence.html）進行耐藥突變位點分析。每個耐藥突變位點有其相對應的對某個藥物的耐藥分值：潛在低度耐藥（P-L）：10 ～14 分，低度耐藥（L）：15～29分，中度耐藥（I）：30～59分，高度耐藥（H）：≥60分。

2 結果

2.1 一般情況 本研究共納入HIV-1感染者111例，以男性為主（90.1%）；年齡 33～54歲居多（65.7%）；婚姻以已婚有配偶較多，占41.4%；文化程度初中、高中或中專居多，占58.5%；傳播途徑以同性性傳播為主（70.3%），見表2。

表2 111例HIV-1感染者基本人口學特征Tab.2 Basic demographic characteristics of 111 HIV-1 infected patients

2.2 病毒亞型分析 111份樣本經巢式PCR擴增，成功擴增100例。進化樹結果顯示，CRF01＿AE（44／100）、CRF07＿BC（21／100）以及 CRF67＿01B（14／100）亞型為主要亞型。 CRF67＿01B、CRF01＿AE、B 亞型以同性性傳播為主，CRF07＿BC亞型中傳播方式最為復雜，其中2例為注射毒品傳播，CRF08＿BC亞型中均通過異性性傳播感染（見圖1）。

2.3 基因型耐藥基因突變位點情況 參照WHO推薦的耐藥突變位點判斷標準，14例HIV-1感染者存在基因型耐藥突變，耐藥率為14.0%（14／100）。核苷類反轉錄酶抑制劑（NRTIs）、非核苷類反轉錄酶抑制（NNRTIs）以及蛋白酶抑制劑（PIs）耐藥突變率分別為3.0%、7.0%、6.0%。NRTIs耐藥突變位點有 T215 A／D、M184 V／I和 K219Q，其中 T215 A／D突變可致AZT類藥物低度耐藥，M184I可致ABC低度耐藥、FTC／3TC高度耐藥；NNRTIs耐藥突變位點有 Y181C、G190 A、V179D、K238 N、H221Y 和M230I，其中 Y181C聯合 G190 A耐藥突變可致EFV／NVP／RPV高度耐藥；PIs耐藥突變位點有M46 L、N83D、L33F和 L10F，M46 L與 L10F 聯合突變可致NFV中度耐藥（表3）。

圖1 江陰市100例HIV-1感染者pol基因進化樹分析Note：Neighbor-joining phylogenetic tree was constructed by Mega 6.06 and the bootstrap value was 1000.Red dots for branch bootstrap values greater than 75%were marked in the picture.The scale representing the distance of genes，was marked at the lower right of the treeFig.1 Phylogenetic tree of HIV-1 pol gene of 100 samples from Jiangyin

2.4 臨床治療耐藥隨訪情況 對111例患者進行為期2～4年隨訪調查，結果顯示14例基因型耐藥患者有9例患者在治療過程中發生了臨床耐藥（表3），耐藥率為 8.1%（9／111）。 隨訪調查顯示：部分患者的病毒載量在治療過程中增高但未檢測出耐藥基因突變位點，未發生臨床耐藥；發生臨床耐藥患者均使用的是一線抗病毒治療方案AZT＋3TC＋NVP／EFV，其中8例出現了耐藥位點相對應的臨床耐藥。本次研究中，發生臨床耐藥患者均為男性，其中5例患者亞型為CRF01＿AE亞型，傳播途徑以同性性傳播為主（7例）。

2.5 HIV亞型與耐藥分布情況 9例發生臨床耐藥患者中，共發現4種不同基因型的HIV患者，分別為 CRF01＿AE、CRF68＿01B、CRF07＿BC 和 CRF02＿AG，CRF01＿AE亞型在臨床耐藥患者中占主要部分（表 3），各亞型耐藥率分別為 11.4% （5／44）、33.3%（2／6）、4.8%（1／21）、100%（1／1）。

表3 9例基因型耐藥患者2～4年臨床隨訪情況Tab.3 2-4 years follow up information of 9 patients with genotypic drug resistance

3 討論

我國自2003年陸續在全國各地開展HIV抗病毒治療，絕大多數患者得到了不同程度的癥狀改善，極大提高了生命質量［4］，早期開展抗病毒治療已成共識［5］。近些年來我市不斷致力于拓寬社區美沙酮維持治療的覆蓋面，有針對性的對娛樂場所涉毒問題進行專項整治，極大降低了靜脈注射毒品導致的艾滋病傳播，在本次研究中僅發現3例吸毒患者（2.7%）。我國主要的 HIV-1流行亞型包括B／B′、01＿AE、07＿BC 和 08＿BC 亞型［6］，本次研究結果顯示，江陰市主要流行的亞型有 CRF01＿AE（44／100）和 CRF07＿BC（21／100），與江蘇省艾滋病疫情主要發生地南京地區流行情況相似［7］。CRF07＿BC首次在中國的吸毒人群中發現，后迅速在全人群中迅速傳播［8］，本研究中發現3例經靜脈吸毒感染患者，其中2例為CRF07＿BC亞型，需要對該亞型人群予以高度重視。

耐藥性檢測結果發現，14例患者存在原發性耐藥突變位點，原發耐藥率 14.0%，對 NRTIs、NNRTIs、PIs耐藥率分別為 3.0%、7.0%、6.0%，有9例患者在治療過程中出現耐藥位點相對的藥物耐藥，耐藥率為8.1%，絕大多數體內含有針對NRTIs／NNRTIs耐藥位點的患者均發生了臨床耐藥，表明抗病毒治療失敗的HIV感染者發生NRTIs／NNRTIs耐藥的情況較普遍，需要引起重視。在NRTIs藥物中，1例患者體內檢測出M184I位點，導致對3TC／FTC高度耐藥。對于NNRTIs藥物，突變位點比較多，除了對一代抗病毒藥物有不同程度耐藥外，也對二代抗病毒藥物產生耐藥性，其中Y181C為ETR高度耐藥突變提供了變異基礎，G190 A雖然不增加ETR的耐藥性，但對ETR的多重耐藥有協同作用，有研究發現，使用二線抗病毒方案的患者抗病毒效果較好，但是檢測出較多的PIs次要耐藥變異，建議在今后的治療中，對更換二線藥物治療患者進行長期耐藥監測，以便及時調制治療方案［9］。另有1例患者體內僅存在針對PIs類藥物耐藥位點，治療藥物為非PIs類藥物，出現臨床耐藥，分析可能的原因是該患者治療期間存在不規則服藥情況，最終發生耐藥位點突變，這與隨訪結果相吻合。研究表明［10］，耐藥與服藥依從性差相關，在本次研究中也發現部分耐藥患者的服藥依從性差，因此加強患者服藥依從性，降低誘發HIV耐藥基因位點突變的可能，仍然是減少耐藥產生的重要手段。9例發生臨床耐藥的HIV-1感染者當中，共發現4種不同亞型患者，以CRF01＿AE亞型耐藥患者為主，但由于樣本量較少，在本次研究中無法估計HIV-1基因型與耐藥發生之間的統計學上的聯系，是本研究不足之處，希望以后在增加樣本量的同時盡可能的收集更多關于抗病毒治療患者的臨床信息，以便更加全面系統的分析耐藥與亞型之間的聯系。

綜上所述，結合本次原發性耐藥檢測結果以及臨床治療耐藥情況分析，新發HIV-1感染者在接受國家免費抗病毒治療前，應該進行耐藥基因檢測，以便制定合理的抗病毒治療方案，促進療效，減少耐藥株的產生與耐藥毒株間的傳播。

利益沖突：無