恒溫擴增熒光檢測技術在基層結核病實驗室的應用價值

馬曉光 鄭丹薇 朱巖昆 石潔 王少華 李輝

結核病發病率及發布例數一直居于我國法定報告乙類傳染病的前列；肺結核是由結核分枝桿菌引起的肺部慢性傳染性疾病，嚴重危害人類的身體健康[1-3]。結核病的病原學檢測是結核病確診和治療的主要依據，也是發現傳染源的主要途徑。目前，我國肺結核的實驗室檢測主要依靠痰涂片(染色鏡檢)和痰培養。然而，傳統的痰涂片檢測敏感度低，且無法區分結核分枝桿菌復合群與非結核分枝桿菌[4]，而痰培養方法雖有較高的敏感度和特異度，但檢測周期長、易發生污染，無法滿足臨床檢測的實際需要。因此，尋求簡便快速、敏感度高、特異度強的檢測方法成為臨床結核病診斷的當務之急。本研究采用恒溫擴增熒光檢測技術，對4276例疑似肺結核患者的痰標本分別進行痰涂片、痰培養和恒溫擴增熒光檢測。以痰培養為標準，對比分析痰涂片和恒溫核酸擴增熒光檢測技術的敏感度、特異度及檢測時間，評價恒溫擴增熒光檢測技術在基層結核病實驗室中的應用價值。

材料和方法

一、研究對象

由于鄧州市結核病防治所、永城市結核病防治所、中牟縣衛生防疫站、新密市疾病預防控制中心等4個縣級單位近年來一直參與結核病耐藥性監測和“十二五”國家科技重大專項的研究，患者資料保存完整和實驗室診斷技術完善，因此選取這4個項目點進行采樣調查。2014年10月1日至2015年9月30日期間，4個項目單位共計納入疑似結核病患者4336例，按照《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》[5]中的要求收集痰標本，每例患者收集3份痰標本(即時痰、夜間痰、晨痰)，涂片后將3份痰標本混合后進行痰培養和恒溫擴增熒光檢測。剔除污染、信息不全、無臨床診斷結果等患者，共納入4276例患者的痰標本。

二、痰涂片抗酸染色顯微鏡檢查

按照《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》[5]中的要求對收集的患者痰標本進行痰涂片、染色和顯微鏡檢操作；萋-尼染色液購自珠海貝索生物技術有限公司。

三、痰標本培養

采用簡單法進行痰標本的培養。將患者痰液用4%氫氧化鈉消化后，振蕩處理并靜置15 min后，用無菌一次性吸管接種于改良酸性羅氏培養基上。于37 ℃條件下進行培養，第3天和第7天各觀察1次，此后每周觀察一次并記錄生長過程，培養至菌落生長或8周后報告無菌落生長。采用噻吩-2羧酸肼(TCH)和對硝基苯甲酸(PNB)生長試驗進行菌種鑒定[6]。對生長菌落進行萋-尼染色，確認是否為抗酸桿菌。改良酸性羅氏培養基購自珠海貝索生物技術有限公司。

四、恒溫擴增熒光檢測

痰培養剩余痰液吸取1 ml至帶蓋離心管中，12 000×g離心5 min，去上清；加生理鹽水1 ml，混勻，12 000×g離心5 min，去上清；加入100 μl DNA提取液，渦旋混勻15 s，煮沸10 min；12 000×g離心2 min，將制備好的DNA轉移至新的離心管中備用。按照n+2(n個待檢樣本+陰性對照+陽性對照)配制擴增液，每管23 μl分裝至PCR管中，將上述含有混勻試劑的PCR管中加入20 μl的密封液，隨后在密封液面以下加入2 μl制備好的DNA及陰性對照和陽性對照，3000×g離心30 s；63 ℃反應45 min，由儀器自動判讀結果。恒溫擴增熒光檢測儀、結核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑盒等購自廣州迪澳生物技術有限公司。

五、統計學處理

計數資料采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。以痰培養為標準，計算恒溫擴增熒光檢測技術、痰涂片的敏感度和特異度，使用Kappa檢驗評估痰涂片、恒溫擴增熒光檢測技術與痰培養的一致率。

六、倫理學審查

本研究由河南省疾病預防控制中心倫理委員會審核批準。參與此次研究的患者均簽署知情同意書，并且整個研究階段均遵循倫理原則。

結 果

一、總體檢測結果

痰涂片檢出陽性者351例，陽性檢出率為8.21%(351/4276)；痰培養檢出陽性者576例，陽性檢出率為13.47%(576/4276)；恒溫擴增熒光檢測技術檢出陽性者733例，陽性檢出率為17.14%(733/4276)；以上3種檢測技術的陽性檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=153.412，P<0.001)。痰培養陽性中有34例恒溫擴增熒光檢測技術檢測為陰性，采用噻吩-2羧酸肼(TCH)和對硝基苯甲酸(PNB)生長試驗進行菌種鑒定，按照《分枝桿菌痰培養標準化操作程序及質量保證手冊》的標準[6]，鑒定為非結核分枝桿菌(NTM)。痰培養陰性中有233例恒溫擴增熒光檢測陽性，進行免疫學菌種鑒定(MPT64)且與臨床診斷復核后，確診為肺結核165例，肺部感染、肺炎等68例。

以痰培養為標準，痰涂片檢測的敏感度為57.29%(330/576)，95%的可信區間為53.12%～61.35%；特異度為99.43%(3645/3666)，95%的可信區間為99.10%～99.63%；陽性預測值為94.02%(330/351)，陰性預測值為93.68%(3645/3891)；一致率為93.70%，Kappa值為0.679。 恒溫擴增熒光檢測技術法的敏感度為86.81%(500/576)，95%的可信區間為83.70%～89.40%；特異度為93.64%(3433/3666)，95%的可信區間為92.79%～94.40%；陽性預測值為68.21%(500/733)，陰性預測值為97.83%(3433/3509)；一致率為92.71%，Kappa值為0.722(表1)。痰涂片與恒溫擴增熒光檢測技術檢測痰標本的敏感度差異有統計學意義(χ2=153.336，P<0.001)。

表1 痰涂片、恒溫擴增熒光檢測技術

注以痰培養為標準，分別計算痰涂片、恒溫擴增熒光檢測技術的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值。計算公式如下：敏感度=真陽性數/(真陽性數+假陰性數)×100%；特異度=真陰性數/(真陰性數+假陽性數)×100%；一致率=(真陽性數+真陰性數)/(真陽性數+假陰性數+真陰性數+假陽性數)×100%，陽性預測值=真陽性數/(真陽性數+假陽性數)×100%；陰性預測值=真陰性數/(真陰性數+假陰性數)×100%

二、各縣級結核病防治機構(簡稱“結防機構”)檢測結果分析

對各個縣結防機構采用恒溫擴增熒光檢測技術的檢測陽性率進行比較，鄧州市結核病防治所該方法檢測陽性率為28.14%；永城市結核病防治所該方法檢測陽性率為13.71%；中牟縣衛生防疫站該方法檢測陽性率為14.36%；新密市疾病預防控制中心該方法檢測陽性率為12.26%。從表2可以看出，4個項目點對3種檢測方法的陽性檢出率比較，差異存在統計學意義(P<0.001)，其中鄧州市結核病防治所3種方法的陽性檢出率均高于其他3個項目點，表明該項目點實驗室檢測能力相對較強。

三、檢測完成時間的比較

痰涂片每份樣本一般檢出時間需要2 h，但檢出率低，從我省數據顯示不到13%。雖然痰培養與痰涂片比較可明顯提高陽性檢出率，但每份樣本出報告的時間較長，需要將近2個月。恒溫擴增熒光檢測技術不僅與痰培養相比較具有較高的陽性檢出率，而且檢測時間較短，和痰涂片檢測時間相近，每份樣本檢測的完成時間大約為2 h，且可以直接鑒定結核分枝桿菌復合群，因此在檢測時間上與傳統痰涂片和痰培養相比有較大的優勢。

表2 各縣級結核病防治機構采用3種方法的陽性檢出率比較

討 論

結核病仍是全球關注的公共衛生問題，全球約有1/3的人口是結核分枝桿菌感染者，且大多集中在發展中國家；結核病是成年人單一感染源致死的主要原因[6]。傳統結核病診斷方法有痰涂片、痰培養。痰涂片操作簡單、快捷，但對于含菌量較少的標本容易漏檢；痰培養為檢測分枝桿菌的標準，陽性檢出率高于痰涂片法，但耗時較長，需2～8周才能報告結果，且痰涂片與痰培養均不能區分結核分枝桿菌復合群和非結核分枝桿菌。

為了準確、快速地檢測結核分枝桿菌，開展分子生物學檢測已成為發展趨勢。比如基于聚合酶鏈式反應技術的檢測、基于分子膜雜交技術的檢測，以及基于基因芯片技術的檢測等[7-8]，但這些技術需要較高的專業知識和復雜的操作技術，并不適合于基層實驗室的使用。恒溫擴增技術是近年來迅速發展的一種檢測手段，由于具有操作簡單、檢測快速、結果準確，以及擴增效率高于普通PCR、檢測成本低廉等優勢，受到了越來越多的關注。并且恒溫擴增技術的反應條件與其他常規的核酸擴增方法相比，要求比較簡單[9]。因為參與反應的嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bst)DNA聚合酶在較寬泛的pH值和溫度范圍內，均能保持較好的生物活性，且其對DNA模板的純度要求較低。所以恒溫擴增技術的整個反應體系具有更好的耐受度。近年來，已有研究者應用恒溫擴增技術檢測方法對結核病患者的臨床標本進行快速診斷和評估[9-10]。

本研究使用恒溫擴增熒光檢測是將恒溫擴增與實時熒光技術相結合，實現了結核分枝桿菌復合群的快速核酸擴增和自動化結果報告。該方法作為一種全新的體外快速診斷技術，通過Bst DNA聚合酶及結核特異性核酸片段的特異性引物，在恒溫條件下對樣本中結核分枝桿菌復合群的核酸片段進行特異性擴增，擴增產物(DNA)與核酸染料結合后發出熒光信號，通過實時讀取熒光信號，根據擴增曲線判讀檢測結果。本研究結果顯示，該方法對結核分枝桿菌復合群檢測的敏感度為86.81%，特異度為93.64%，并且該方法與痰培養檢測結果的Kappa值為0.722，說明其與痰培養結果比較具有非常好的一致性。同時4個項目點的數據顯示恒溫擴增熒光檢測與痰涂片和培養相比，明顯提高了陽性檢出率。由于該方法具有較好的敏感度和特異度，并且操作簡單、生物安全性高、檢測過程不易受干擾，因此可在基層實驗室作為快速檢測技術用于結核病的診斷。