國內外結核病預防用卡介苗質量標準比較

趙愛華 王國治 付麗麗 徐苗

卡介苗是目前唯一可用的能預防結核病的疫苗[1]，在我國是計劃免疫疫苗，1978年即納入國家免疫規劃，《國家免疫規劃兒童免疫程序及說明(2016年版)》要求新生兒出生時接種。因此卡介苗是接種者年齡最小的疫苗，同時也是接種后異常反應報道較多的疫苗[2-3]。國內目前供應計劃免疫用卡介苗的生產企業為上海生物制品研究所有限責任公司和成都生物制品研究所有限責任公司。兩家企業年獲得簽發總量約5千萬人份，每年約有1千萬名兒童接種卡介苗。近年來，聯合國兒童基金會(UNICEF)每年卡介苗需求量超過1億人份，主要由日本、丹麥、保加利亞等國家的卡介苗生產企業提供，其他國家如俄羅斯、巴西則主要供應本國使用。

隨著人們對國產疫苗有效性與安全性的日益關注，部分民眾認為進口疫苗優于國產疫苗，那么國產卡介苗與國外卡介苗在質量標準上是否有差異？筆者僅對國內外卡介苗生產與質量控制的標準進行簡要的分析比較，以便了解中國與國際上卡介苗質量控制研究與發展的概況，供同行參考。

我國卡介苗質量標準概況

制定疫苗質量規程的目的是保證生產疫苗的質量，確保疫苗安全、有效。針對計劃免疫用疫苗，世界衛生組織(WHO)也會發布相關建議，供世界各國參考，對于卡介苗質量其最新技術規范(WHO TRS 979)于2013年發布[4]，主要質量控制(簡稱“質控”)內容包括種子批質控、生產過程質控及成品質控。我國卡介苗質量標準參考《中國人民共和國藥典(2015年版)》[5]，同時執行皮內注射用卡介苗2個局頒標準，分別為國家食品藥品監督管理局注冊標準WS 4-(ZB-010)-2010和WS 4-(ZB-004)-2010，也是上海與成都生物制品研究所有限公司的企業注冊標準，2個國家局頒布標準質控項目與藥典項目完全一致。我國卡介苗質量標準基本涵蓋了世界衛生組織建議的相關內容，下面具體分析種子批質控、生產過程質控及成品質控方面與歐洲藥典[6]的差異。

一、種子批質控的差異

對于種子批質控，WHO卡介苗推薦項目包括鑒別試驗、3項安全性試驗(細菌和真菌污染檢查、無有毒分枝桿菌試驗、過度皮膚反應試驗)，1項效力試驗(遲發超敏反應)、1項菌株特性試驗(抗生素敏感性)，共6項。我國藥典含鑒別試驗、3項安全性試驗(純菌檢查、毒力試驗、無有毒分枝桿菌試驗)，1項效力試驗(免疫力試驗)，共5項。歐洲藥典僅鑒別試驗與2項安全性試驗項目(細菌和真菌污染檢查、無有毒分枝桿菌試驗)，共3項。主要差異在于效力試驗歐洲藥典不涉及，WHO推薦采用細胞免疫反應標志的結核菌素遲發超敏反應作為效力指標，中國藥典采用結核分枝桿菌攻毒后BCG免疫動物臟器荷菌量的降低作為效力指標。結核菌素試驗是無論結核分枝桿菌感染、卡介苗接種或非結核分枝桿菌感染都顯示陽性的試驗，一是無特異性，二是該指標為非疫苗誘導抗結核保護力的直接指標，只能提示卡介苗免疫成功。而中國藥典采用的動物抗結核分枝桿菌攻擊的評價方式能直接顯示種子批誘導的抗結核免疫力水平，多年來給更換的種子批進行的保護力評價，結果基本一致[7]。另外歐洲藥典9.0版是從2017年開始執行，對于WHO建議的抗生素敏感性試驗，雖然未列入種子批項目，但也要求對該項進行評價。我國藥典尚未設置該項檢測；但中國食品藥品檢定研究院(簡稱“中檢院”)的評價結果顯示，我國卡介苗菌種的抗生素敏感性與其相同來源的丹麥菌種(BCG Danish1331)一致(數據待發表)。具體的國內外種子批質控項目差異見表1。

二、生產過程質控項目的差異

對于生產過程的質控，WHO卡介苗推薦項目包括濃度測定、活菌數測定，還包括2項安全性試驗(細菌和真菌污染檢查、無有毒分枝桿菌試驗)，共4項。歐洲藥典與我國藥典均不在生產過程中涉及無有毒分枝桿菌試驗。

眾所周知卡介苗的不良反應與疫苗本身的濃度、均勻度與活菌量有關。卡介苗的生產首先是菌種復蘇，其次是菌體傳代擴大培養，以收集足夠的菌體用于菌液的制備。但由于卡介苗的疏水特性，因此其培養的菌體浮于液體培養基的表面，形成一層菌膜，收集菌體后需要將這些菌膜研磨成小的菌塊，形成均勻的菌液后再稀釋分裝。若收集的菌體研磨不均勻，則會導致制品中含有大量的菌塊，臨床接種后可能導致不良反應風險的增加。因此，我國藥典設置了沉降率項目，通過評價沉降率大小，間接了解菌液的均勻性。同時與濃度指標、活菌數指標同時控制，避免由于菌塊過大、菌體過多、活菌數過高而導致的臨床接種不良反應，這是在生產過程中從疫苗因素本身來避免發生臨床不良反應的質控措施。我國藥典在半成品項下還設置了活力測定項目，主要基于卡介苗半成品至成品分裝周期短，同時活菌數檢測周期需要4～5周的現狀，采用生物化學方法短時間內獲得制品的活菌狀況。WHO推薦規范僅將該項目置于成品項下(表1)。

三、成品質控項目的差異

對于成品質控，WHO推薦項目含9項，歐洲藥典5項，中國藥典8項，但具體檢測項目中國藥典有10項。國外藥典與中國藥典主要的質控項目的差異在于過度皮膚反應，該項目同樣涉及種子批的檢定，并說明工作種子批及來自本工作種子批連續五批或三批成品該項檢測結果均合格，則成品此項檢測可省略。推測設置該項目的目的可能是考察菌種及其所制備疫苗接種后導致不良反應的程度。中檢院曾對我國卡介苗生產用工作種子批，國內兩家卡介苗企業生產的47批疫苗成品進行了該項目的檢測，結果發現我國皮內注射用卡介苗菌種工作種子批和成品的過度皮膚反應直徑及活菌數與國家參考品無差異；同時我國卡介苗制品的過度皮膚反應程度也低于國外疫苗制品，推斷過度皮膚反應與菌種、濃度、均勻度及活菌數都有關；在確定菌種的情況下，可能與疫苗制造過程中顆粒大小的均勻度、濃度及活菌數的關聯性更大；我國卡介苗生產規程通過對濃度、沉降率、活菌數的控制，可以從生產過程中控制成品引起皮膚反應的程度。因此，過度皮膚反應試驗目前在我國卡介苗生產規程中設置的意義并不大。

表1 國內外卡介苗質控項目的差異

注“-”代表該藥典或規范中不做此項檢定

卡介苗是活菌疫苗，活菌易受到環境溫度的影響而導致活菌數改變，進而影響疫苗的質量；因此，要對制品進行熱穩定性試驗，以評價疫苗的穩定性。我國熱穩定標準為25%，即在37 ℃條件下放置28 d進行加速破壞試驗樣品的活菌數與2～8 ℃保存的同一批疫苗活菌數比較不得低于25%，并不得低于2.5×105菌落形成單位(CFU)/mg。國外的熱穩定標準為20%[5]。我國藥典對卡介苗質量標準中關于卡介苗活菌數僅設置了下限，即不低于1.0×106CFU/mg。而目前企業設置的放行標準在2.0×106CFU/mg以上；檢定機構在疫苗上市前的批簽發過程中，設置上下警戒限在2.0×106CFU/mg～8.0×106CFU/mg ，以確保制品的批間一致性。

通過上述國內外卡介苗質量標準的比較，可見WHO技術規范(WHO TRS 979)推薦更多的安全性檢測，但從項目設置中國藥典涵蓋了世界衛生組織的技術規范(WHO TRS 979)的大部分內容，而歐洲藥典則相對較少。

我國卡介苗菌種概況

菌種是影響卡介苗有效性與安全性的最主要因素，卡介苗是一株牛分枝桿菌經過13年230余代連續培養獲得的減毒株，自1921年應用于人體后，卡介苗原始菌株被分發到全球各地，經不同實驗室、不同傳代方式，形成了培養特性、遺傳特性各不相同的10余種疫苗生產株。國際上應用較多的疫苗生產用菌種包括，法國巴斯德株(BCG Pasteur 1173 P2)，丹麥1331株(BCG Danish 1331)，巴西株(BCG Mearou-RJ)，俄羅斯株(BCG Moscow 368)，保加利亞株(BCG Sofia SL 222)和日本172株(BCG Tokyo-172-1)等。我國現用卡介苗生產用菌種，源自1948年引進的共傳了823代的丹麥菌種(BCG Danish 823)，該菌株經北京、上海、蘭州培養后發生變異，形成上海D2株、北京D1株及蘭州株(D2L)等，其中上海D2株于1974年12月29日凍干保存，稱為BCG D2 PB302SⅡ甲10菌株，即現在計劃免疫卡介苗的生產株，1993年全國統一使用BCG D2 PB302SⅡ甲10菌株生產卡介苗。

一、我國卡介苗菌種遺傳學特性與國外菌種的差異

國際上不同卡介苗亞株的遺傳特性各不相同[8]，我國卡介苗菌種為BCG Danish 823 傳代菌種，與目前廣泛應用的BCG Danish 1331在遺傳學特性上有差異。我國卡介苗菌種同所有其他卡介苗亞株相同，都特異性缺失卡介苗在減毒過程中的缺失序列RD1，與BCG Danish 1331一樣都缺失RD2，不缺失RD8、RD14、RD16、nRD18，含有一個IS 6110插入序列，但不同于BCG Danish 1331，含有RDDenmark/Glaxo 序列；SenX3-RenX3 基因座有3個串聯重復序列，而BCG Danish 1331 含有2個或3個串聯重復序列[9-10]，同時我國菌種與BCG Pasteur 1173 P2及BCG Tokyo-172-1有更明顯的差異,其中日本株中含有2個亞型[11]。

從丹麥株和日本株的遺傳學檢測結果可以了解其菌株中含2個亞型，說明菌種不均一。早在20世紀70年代，Dam 等[12]就指出雖然各國制造BCG菌株均來源于法國巴斯德研究所，但由于當初的菌株不是采自單株菌落，而是混合菌落，因此使各菌株間在免疫力及減毒方面不可避免地會有一定程度的差異，同時也說明了傳代對菌株的影響。目前，世界上的上市疫苗的菌種均是復合菌種；為減少傳代代次對卡介苗效力的影響，并且使卡介苗疫苗生產管理更規范化，應該了解復合菌種與其中的不同單細胞克隆菌種在保護力方面的差異。2009年中國食品藥品檢定研究院將我國早期1956年凍干的卡介苗菌種進行復蘇并擴增傳代，其國內外總計傳代944代，2014年以微孔濾膜方式從中制備單細胞克隆系列共5株，根據單細胞克隆菌落的培養特性與遺傳學特性，進行動物抗結核感染的保護效果篩選，獲得目前唯一的一株單細胞克隆生產用菌種，由該菌種生產的卡介苗已獲得藥物臨床批件。

二、我國卡介苗菌種動物保護力與國外菌種的差異

盡管卡介苗已經有百年應用歷史，但迄今缺少系統的、不同卡介苗菌株人體保護力的比較研究資料；在無人體使用效果的相關數據情況下，動物保護力成了菌株保護力的主要評價標準依據。

早在20世紀50年代，我國就在開展的卡介苗菌種篩選工作中，比較了我國卡介苗與國外菌株動物保護力的差異。選擇卡介苗免疫后感染結核分枝桿菌的小鼠存活率為評價指標，評價了包括上海 D2株、北京D1株、巴西株、巴斯德株、蘇聯株、匈牙利株在內的8株卡介苗菌株。結果顯示上海 D2株保護效果最佳，保護力優于其他菌株，平均存活率為56.0%，匈牙利株保護力最低，平均存活率僅16.0%[13]。

近年又采用豚鼠模型評價我國的BCG D2 PB302與丹麥株(BCG Danish 1331)、巴斯德株(BCG Pasteur 1173 P2)、布拉格株(BCG Prague)及匈牙利株(BCG Hungary)的動物保護力差異， 結果與20世紀50年代的結果一致，匈牙利株的保護力最低，而BCG D2 PB302呈現優良保護力，與BCG Danish 1331、BCG Pasteur 1173等其他亞株保護效果基本一致。該實驗與早期小鼠模型試驗間隔近60年，但結果完全一致[14]。

我國卡介苗接種現狀

由于《預防接種工作規范(2016年版)》并不要求進行PPD陽轉率的卡介苗免疫效果評價[15]，因此我國并無大規模卡介苗接種效果考核數據。根據文獻報道，我國卡介苗接種覆蓋率高，可達90%以上，接種3個月后PPD陽轉率通常達90%，甚至95%[16-18]；說明我國卡介苗接種后能誘導很好的免疫反應；同時在技術熟練的接種人員進行操作的情況下，不良反應也并不常見。筆者參與的一項對近3萬名新生兒進行卡介苗接種的臨床研究顯示，接種人員經過培訓后接種，PPD陽轉率高達97%，發生不良反應者僅19例，其中11例為卡介苗特異性的淋巴結反應[19-20]。根據我國多年來疑似預防接種異常反應(adverse events following immunization，AEFI)的監測數據顯示，我國卡介苗淋巴結反應發生率為15.1/100萬劑～54.43/100萬劑[21-23]，低于WHO估測的卡介苗化膿性淋巴結炎發生率范圍(1/萬～10/萬)[24]。

小 結

以上分析可見，我國有自己的卡介苗生產用菌種；我國卡介苗動物保護效果與國際常用菌株基本一致；有可以生產卡介苗的生產企業，能自主生產并提供每年5千萬人份的疫苗。我國卡介苗質量標準對控制產品與不良反應相關的安全性標準，如濃度、均勻度、半成品活力、異常毒性實驗等指標均高于國際標準，在有效性指標中我國對卡介苗在工作種子批的評價采用更為嚴格的成品動物感染保護力評價指標；在活菌熱穩定性評價標準上，國內標準較WHO的推薦標準高；我國生產的卡介苗接種后能誘導很好的免疫反應，不良反應在正常范圍內；上述這些情況，都是我國不選用進口卡介苗的原因。由于卡介苗接種人群的特殊性，檢定機構應該重點關注卡介苗質量，還需不斷地修訂相關的質量標準，進一步提高我國衛生健康與結核病防治的服務水平。