實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術輔助診斷肺外結核的臨床價值

聶曉平 李桓 楊洪英 羅明 楊國強 周刊 黃正谷 王鵬森 廖傳玉 張匯征 周剛 陳玉 陳耀凱 石濤 李同心

結核病是一種長期危害人類身體健康的慢性傳染病，其臨床表現多樣，其中80%發生在肺部，其他部位(頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼等)也可繼發感染[1]。WHO[2]在《2015年全球結核病報告》中指出，我國2014年臨床確診近53萬例新發患者中有3.2萬例肺外結核患者。肺外結核由于病變部位廣泛、臨床表現復雜多樣，早期診斷和鑒別診斷較為困難。

快速、敏感的實驗室檢測技術是輔助臨床提高肺外結核早期診斷的重要手段。實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(simultaneous amplification and testing，SAT)是近年來我國結核實驗室使用的分子生物學檢測方法之一，主要用于檢測痰液里的結核分枝桿菌(MTB)來輔助診斷肺結核患者[3-9]。為了明確SAT用于重慶區域肺外結核輔助診斷的臨床價值和意義，本研究對該類患者樣本采用SAT、羅氏培養和液體培養(以下兩種培養方法簡稱“培養法”)同步檢測并比較結果，評估其敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值等指標。

資料和方法

一、研究對象、試驗儀器及試劑

1.標本來源：連續收集重慶市公共衛生醫療救治中心結核科、普通外科與骨科2016年1月至2017年12月期間收治482例患者的送檢標本(主要為病變部位的膿液或手術取出物)；含433例肺外結核(作為試驗組)和49例排除結核病的其他疾病(作為對照組)，全部患者均由結核專科醫生臨床確診，診斷肺外結核和排除結核病參照文獻[10-14]，診斷不明確的不納入本研究。其中，男259例，女223例，年齡范圍7～79歲，平均年齡(35.5±17.1)歲， 12例患者臨床血液檢測HIV抗體為陽性。對照組49例患者中有10例頸部淋巴結炎，6例胸膜炎，6例膝關節炎，6例腰椎融合術后，5例膝關節置換術后，4例液氣胸，3例腹股溝膿腫，3例腋窩淋巴結炎，2例肛周膿腫，2例踝關節炎，2例心包積液，1例睪丸鞘膜積液。本研究均取得患者知情同意和重慶市公共衛生醫療救治中心學術倫理委員會同意。結核分枝桿菌標準參考菌株(H37Rv)來源于中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室。

2.主要儀器及試劑來源：本研究使用的BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養監測系統、雜菌抑制劑(PAN-TA)、分枝桿菌培養管(MGIT)及營養添加劑(OADC)均來源于美國BD公司。BIO-RAD CFX96實時熒光定量PCR儀來源于美國伯樂公司。中性改良羅氏培養基購于珠海銀科醫學工程有限公司。結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(RNA恒溫擴增法，商品名為“TB-SAT”)購于上海仁度生物科技有限公司。結核分枝桿菌復合群核酸提取、檢測試劑盒(實時熒光PCR法)和Lab-Aid 824型自動核酸提取儀購于廈門致善生物科技股份有限公司。分枝桿菌菌種鑒定基因檢測試劑盒購于亞能生物技術(深圳)有限公司。

二、方法

1.標本采集：患者病變部位的膿液或手術過程中取出物由臨床醫生留取，低溫保存，及時送檢。

2.標本前處理：標本前處理按照《分枝桿菌分離培養標準化操作及質量保證手冊》[15]堿處理-中和離心沉淀法的要求進行，離心后的沉淀物用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，均等分為3份，留1份于-20 ℃備用，另2份分別用于結核分枝桿菌分離培養和TB-SAT檢測。

3.標本分離培養：取1份重懸液，按照《分枝桿菌分離培養標準化操作及質量保證手冊》[15]和BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養監測系統操作說明書將PBS重懸后的沉淀物同步接種于MGIT和中性羅氏培養基。結果記錄參照《分枝桿菌分離培養標準化操作及質量保證手冊》[15]。本研究中以上2種培養方法任意一種結果為陽性，即視為樣本培養結果為陽性。

4.標本TB-SAT檢測：取一份重懸液按照TB-SAT 試劑說明書操作，具體步驟：離心半徑8.8 cm，13 000 r離心 5 min ，棄上清，再用1 ml無菌生理鹽水洗滌1次后加入50 μl TB裂解液重懸，超聲(功率300 W)處理15 min。取樣前，離心半徑8.8 cm，10 000 r 離心 2 min。取2 μl離心后樣本上清液加入含30 μl擴增檢測液的微量反應管中，將微量反應管置于干熱恒溫器上60 ℃保溫10 min，再置于42 ℃保溫5 min，同時將反應酶預熱至42 ℃，最后向每支反應管中加入10 μl反應酶，迅速混勻并轉至實時熒光定量PCR儀。反應程序：熒光通道設定為羧基熒光素(FAM)，每個循環為42 ℃、1 min，共40個循環；熒光信號收集1次/min，共檢測40次。閾值設定：以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點。結果判斷標準：陽性判斷值(dt)≤35的樣本為陽性；dt為35～40的樣本建議重新檢測，重測結果dt<40為陽性；dt無數值或為40的樣本為陰性。質量控制：每次檢測都必須做陰性和陽性對照，且陽性對照dt≤35，陰性對照無數值或為40，否則需重復試驗。

5.MTB鑒定：對培養法和TB-SAT結果不一致的樣本進行MTB鑒定。取備用的重懸液按照廈門致善生物科技股份有限公司生產的結核分枝桿菌復合群核酸提取、檢測試劑盒(實時熒光PCR法)說明書進行DNA提取和結核分枝桿菌復合群鑒定。

6.分枝桿菌菌種鑒定：對培養法陽性、TB-SAT結果陰性的樣本，進一步對培養陽性的菌株進行分枝桿菌菌種鑒定。按照亞能生物技術(深圳)有限公司生產的分枝桿菌菌種鑒定基因檢測試劑盒說明書，采用反向點雜交法進行分枝桿菌菌種鑒定。

三、統計學處理

醫院信息系統(hospital information system，HIS；為上海瑞美電腦科技有限公司產品)檢索統計患者病歷信息，采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。分別與培養法、患者臨床診斷比較，計算SAT檢測方法的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值。培養法和SAT檢測MTB的陽性率比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、TB-SAT與培養法MTB檢測結果比較

本研究共納入433例肺外結核患者的標本：127例培養法陽性的標本中TB-SAT檢測結果為陽性者有107例，陰性結果有20例；306例培養法陰性的患者中TB-SAT檢測結果為陽性者有73例，陰性結果有233例。49例對照組樣本中有1例標本為培養法陽性、TB-SAT檢測結果陰性，其余48例標本培養法與TB-SAT檢測結果均為陰性。試驗組培養法的陽性檢出率為29.3%(127/433)，TB-SAT 陽性檢出率為41.8%(181/433)；對照組培養法陽性檢出率為2.0%(1/49)，TB-SAT陽性檢出率為0.0%(0/49)。試驗組TB-SAT與培養法兩者的陽性率差異有統計學意義(χ2=30.20 ，P<0.05)，對照組TB-SAT與培養法兩者的陽性率差異無統計學意義(χ2=0.00 ，P>0.05)，見表1。

以培養法為標準，則TB-SAT檢測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和符合率分別為83.6%(107/128)、79.4%(281/354)、59.4%(107/180)、93.0%(281/302)、83.6%(107/128)。以臨床診斷作為標準，則培養法的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和符合率分別為29.3%(127/433)、98.0%(48/49)、99.2%(127/128)、13.6%(48/354)、36.3%(175/482)；TB-SAT檢測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和符合率分別為41.6%(180/433)、100.0%(49/49)、100.0%(180/180)、16.2%(49/302)、47.5%(229/482)，詳見表2。以臨床診斷為標準，兩種方法檢測陽性率培養法為29.3%(127/433)，SAT法為41.6%(180/433)(χ2=14.17，P<0.05)。

表1 兩組患者分別采用TB-SAT與培養法的檢測陽性率比較

表2 兩組患者TB-SAT與培養法檢測結果及以臨床診斷為標準對兩種方法檢測結果的比較

注各項指標定義：敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性人數)×100%，特異度度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%，陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%，陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%，符合率=(真陽性例數+真陰性人數)/總例數×100%

二、TB-SAT與培養法檢測結果不一致的樣本MTB鑒定結果

482例樣本中TB-SAT與培養法檢測結果不一致的樣本有94例，其中TB-SAT檢測結果陽性、培養法檢測結果陰性的樣本有73例(均來自試驗組)；TB-SAT檢測結果陰性、培養法檢測結果陽性的樣本有21例(僅1例來自對照組)。對兩種檢測方法結果不一致的樣本進行MTB鑒定，結果顯示：試驗組73例TB-SAT檢測結果陽性，培養法檢測結果陰性的樣本中MTB鑒定結果陽性有70例，陰性有3例；試驗組20例TB-SAT檢測結果陰性、培養法檢測結果陽性的樣本中MTB鑒定結果陽性有3例，陰性有17例。1例對照組TB-SAT檢測結果陰性、培養法檢測結果陽性的樣本MTB鑒定結果為陰性。

三、分枝桿菌菌種鑒定結果

TB-SAT結果陰性、培養法陽性的菌株有21株(例)，分枝桿菌菌種鑒定結果顯示：3株(例)為胞內分枝桿菌，1株(例)為龜分枝桿菌膿腫亞種，1株(例)為戈登分枝桿菌，其余16株(例)為MTB(含試驗組3例TB-SAT檢測結果陰性、培養法檢測結果陽性且MTB鑒定結果陽性的樣本)。

討 論

SAT是將新一代的核酸恒溫擴增技術和實時熒光檢測技術相結合的一種新型核酸檢測技術。該技術原理：同一溫度下，首先通過莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus) 逆轉錄酶(M-MLV RT)產生靶標核酸(RNA)的一個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7 RNA多聚酶從該DNA拷貝上產生多個(100～1000個)RNA拷貝；每一個RNA拷貝再從反轉錄開始進入下一個擴增循環；同時，帶有熒光標記的探針和這些RNA拷貝特異結合，產生熒光，該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，實時反映擴增循環情況。近年來該技術廣泛應用于臨床檢測痰液中的MTB，以早期診斷肺結核，但用于檢測肺外結核的臨床價值報道少見。

本研究同步采用羅氏培養法、液體培養法和SAT三種方法檢測肺外結核標本MTB，共納入482例患者，研究結果較客觀、準確。以培養法為標準，則TB-SAT檢測的敏感度、特異度分別為83.6%(107/128)、79.4%(281/354)，兩種方法符合率為83.6%(107/128)。以臨床診斷為標準，則培養法的敏感度、特異度分別為29.3%(127/433)、98.0%(48/49)；TB-SAT檢測的敏感度、特異度分別為41.6%(180/433)、100.0%(49/49)。多數文獻報道，SAT應用于檢測痰液中MTB的敏感度在37.6%～56.5%之間[16-19]；方法相同，卻有一定的差異。Fan等[20]研究者認為，差異與痰標本的處理、運輸和局灶性肺結核等原因有關，與方法本身關系不大。以臨床診斷作為標準，本研究SAT檢測的特異度為100.0%(49/49)，高于培養法的特異度[98.0%(48/49)]，主要由于SAT檢測陽性結果可以排除NTM的單一感染或確定MTB感染；SAT和培養法均不能區分同一患者MTB和NTM的混合感染。SAT一般可在2 h內完成，培養耗時較長，當SAT和痰涂片結果均為陽性，不需要等待培養結果即可及時明確患者是否感染MTB。本研究SAT陰性預測值較低，提示臨床醫生不能依據該檢測結果排除結核病，臨床上仍需要借助其他檢查結果以明確診斷。

羅氏培養法檢測分枝桿菌是傳統且經典的實驗室方法，長期以來被認為是診斷結核病的金標準，通常其檢測結果也作為評估新MTB檢測試劑的金標準。考慮分枝桿菌自身活力、L型，以及羅氏培養基營養條件等因素影響，本研究采用羅氏培養法和液體培養法同時檢測標本，以期提高培養法檢測結果的敏感度。實時熒光PCR法檢測MTB核酸試劑有著較高的敏感度和特異度，當SAT與培養法檢測結果不一致時，本研究采用另一種實時熒光PCR檢測試劑進行評價。也有大型隊列研究進一步分析了SAT檢測方法的敏感度，當檢測結果不一致時，進行一次SAT重復檢測，其檢測敏感度可達75.8%[21]。本研究對94例TB-SAT與培養法檢測結果不一致的標本進行MTB鑒定，TB-SAT與實時熒光PCR法一致率為92.6%(87/94)。為了進一步證實前述各方法的一致性，本研究對21例TB-SAT 結果陰性、培養法陽性的菌株進行了分枝桿菌菌種鑒定，結果顯示僅有5例為NTM，另16例為MTB，占76.2%(16/21)，即臨床上不能忽視SAT陰性而培養陽性的患者感染MTB的可能性。3例TB-SAT結果陰性、培養法陽性而MTB鑒定為陽性，分析原因可能標本中含有影響TB-SAT 擴增反應的雜質，或者非痰液樣本(如膿液、組織等)的特殊成分構成導致樣本中MTB分布不均，或樣本中MTB菌量較少、裂解液中模板分布不均勻等。73例培養法陰性、TB-SAT陽性的樣本經PCR法鑒定，結果顯示70例TB-SAT與PCR法均為陽性，占95.9%(70/73)；另3例培養陰性、TB-SAT 陽性、PCR法為陰性的樣本沒有進一步試驗證實，這也是研究的不足之處。

SAT除了具有反應穩定、敏感度與特異度較高等優點外，該技術實驗室反應條件簡單，操作簡便，不需要溫度循環，其擴增效率高，反應時間短；RNA擴增產物和模板均為RNA，RNA容易降解，可大大減少實驗室污染。

綜上所述，TB-SAT檢測是一項簡便快速、敏感度和特異度較培養法高的結核病檢測方法，臨床上可應用于輔助診斷肺外結核，同時可在一定程度上提高培養陰性肺外結核患者的陽性檢出率。