細胞因子基因多態性與肺結核并發糖尿病易感性的相關性研究

董斯佳 袁立 陳誠 蔣偉利 趙琦

結核病(tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌引起的一種慢性感染性疾病，世界衛生組織(WHO)[1]2017年全球結核病報告指出，2016年全球新發結核病1040萬例，約160萬例死亡，是世界范圍內第九大死因，也是單一傳染因素的首要原因。糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組由遺傳和環境等因素共同作用導致的慢性代謝性疾病，其特點是慢性的高血糖伴發碳水化合物、脂肪和蛋白質代謝紊亂。研究表明，兩病的發生、發展和轉歸存在密切聯系[2-3]，TB并發DM(tuberculosis and diabetic mellitus，TB-DM)已成為威脅人類生命和健康的重大衛生問題[4]。由于TB和DM的發生均與遺傳因素有關，探索遺傳因素在TB-DM發病機制中的作用能夠為今后開展基于TB-DM高危人群的基因遺傳篩查和預防TB-DM的發生有重要意義[5]。既往研究顯示，許多基因均被證明與TB和DM的易感性存在關聯，其中白細胞介素 10(IL-10)和γ-干擾素(IFN-γ)受到廣泛關注[6-10]；但與共患疾病相關基因多態性及其差異的報道較少，目前涉及的包括人類淋巴細胞抗原(HLA)基因、Toll樣受體4(TLR4)、IL-10等[11]。本研究以肺結核(pulmonary tuberculosis，PTB)并發DM(pulmonary tuberculosis and diabetic mellitus，PTB-DM)患者、PTB患者、DM患者為研究對象，通過選取與PTB和DM易感性相關、關注較多的IFN-γ和IL-10作為候選基因，研究其與疾病共患易感性的關系，探索PTB-DM發病的危險因素和發病機制。

對象和方法

一、研究對象

1.一般情況：采取目的性抽樣方法，抽取華東地區江蘇省內徐州市下轄的新沂市和睢寧縣、南京市鼓樓區作為研究現場，選取2013年4月1日至2014年3月31日間上述研究現場TB防治定點機構新診斷登記的142例涂陽PTB-DM患者(PTB-DM 組)，并同期選取新診斷的147例PTB患者(PTB組)、141例DM患者(DM組)作為對照，共計430例納入研究。142例PTB-DM患者中，男95例(66.90%)、女44例(33.10%)，性別缺失3例，平均年齡為(50.22±18.86)歲；147例PTB患者中，男102例(69.39%)、女45例(30.61%)，平均年齡為(49.58±19.40)歲；141例DM患者中，男96例(68.09%)、女45例(31.91%)，平均年齡為(53.00±16.15)歲。三組間年齡(F=1.422，P=0.242)和性別(χ2=0.064，P=0.969)比較，差異均無統計學意義，組間具有可比性。

2.患者納入標準: (1) PTB診斷依據《WS 288—2008 肺結核診斷》標準[12]，結合實驗室細菌學檢查 (痰涂片萋-尼染色鏡檢)、胸部影像學檢查、流行病學資料、臨床表現，以及必要的輔助檢查進行綜合分析。本研究納入者均為涂陽PTB患者。(2) 診斷DM時，所有患者在治療前均檢測空腹血糖，若空腹血糖≥7.0 mmol/L則進一步行糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，GHb)檢測，若GHb≥6.5%則確診為DM。

3.患者排除標準：(1)所有患者均排除自身免疫性疾病、肝腎疾病、過敏性疾病、腫瘤等。(2)近3個月來罹患肺炎，或者服用糖皮質激素、利尿劑等特殊藥物，或抽取靜脈血當日體溫超過38.5 ℃者均不入組。

二、研究方法

1.問卷調查：采用統一自行設計的調查表[13]，由經過培訓的調查員填寫并每個月對收集的調查問卷進行現場質量控制。內容包括調查對象的一般人口學特征(包括性別、年齡等)、社會特征、經濟學信息(包括受教育程度、經濟狀況等)、慢性病病史(特別是DM病史及家族史等)，以及DM相關危險因素調查(如飲食、運動習慣等)；PTB患者另附調查相關就診經歷、治療經歷；DM患者另附DM診療經歷等信息收集表。共計發放問卷430份，回收430份，有效問卷430份。

2.基因組DNA提取：經研究對象知情同意后，采集外周靜脈血5 ml，置于抗凝管中，采用1 ml血液基因組DNA提取試劑盒(上海萊楓生物科技有限公司)，按照說明書方法提取DNA，于-80 ℃深低溫冰箱凍存。

3.IFN-γ和IL-10單核苷酸多態位點(SNP)選擇：參考已有文獻報道[6-9, 11]的與PTB-DM、DM、TB易感性均存在關聯的功能性SNP位點，最終將IFN-γ +874A/T、IL-10 -592A/C、IL-10 -1082G/A納入研究。

4.PCR擴增：采用上海生工生物工程公司PCR擴增試劑盒，引物序列由上海生工生物公司合成。IFN-γ+874A/T上游為5′-AAAACAGCAAAGCCACCC-3′，下游為5′-TTTTATTCTTACAACACAAAATCAGA-3′；IL-10 -592A/C上游為5′-TCCAGCCACAGAGCTTACAAC-3′，下游為5′-AGGTCTCTGGGCCTTAGTTTCC-3′；IL-10 -1082G/A上游為5′-CCAAGACAACACTACTAAGGCTCCTTT-3′，下游為5′-GCTTCTTAT-ATGCTAGTCAGGTA-3′。PCR反應總體積為15 μl，其中DNA 0.5 μl、上游引物0.2 μl、下游引物0.2 μl、預混液(Mix) 3.1 μl、水(dH2O)11 μl。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min、變性30 s，68 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s；共20個循環，每次-0.5 ℃。隨后再進行20個循環反應(每個循環包括95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s、72 ℃ 6 min)，最后72 ℃延伸6 min。

5.限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，RFLP) 鑒定：擴增產物分別用Bg1Ⅱ(IFN-γ+874A/T)、RsaⅠ(IL-10 -592A/C)、EcoNⅠ(IL-10 -1082G/A)限制性內切酶進行酶切，酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，根據電泳圖中條帶的數目判斷基因型。各基因位點分型標準：IFN-γ +874A/T位點基因型分別為AA(182 bp)、AT(182 bp、161 bp、21 bp)、TT(161 bp、21 bp)，IL-10 -592A/C位點基因型分別為AA(236 bp、176 bp)、AC(412 bp、236 bp、176 bp)、CC(412 bp)，IL-10 -1082G/A 位點基因型分別為GG(253 bp、97 bp、27 bp)、GA(280 bp、253 bp、97 bp、27 bp)、AA(280 bp、97 bp)。

依上至下分別為 IFN-γ+874A/T、IL-10 -592A/C、IL-10 -1082G/A 位點的酶切結果電泳圖，各圖中位置9為Marker圖1 基因多態性位點酶切結果電泳圖

三、統計學處理

采用Hard-Weinberg 遺傳平衡檢驗數據，以明確群體是否具有遺傳平衡，若符合遺傳平衡則證明本次研究所選對象基因和基因型頻率沒有發生遷移、突變和選擇，樣本來自遺傳平衡狀態的人群，符合大群體中基因頻率和基因型頻率的遺傳規律，群體的遺傳性能相對穩定，具有一定代表性。

采用在線分析軟件SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)對IL-10 -592A/C和-1082G/A位點之間進行連鎖不平衡分析,以說明某些組合單倍型在遺傳適應性上具有優勢，以P<0.05表示SNP之間存在連鎖不平衡，以相對大小D′和相關系數r2表示SNP之間存在的連鎖不平衡程度[14]，但由于SHEsis在線軟件進行單倍型分析時，有些單倍型的頻率非常低，很有可能會影響分析結果而產生偏差，故本研究將最低頻率閾值設定為0.03，所有頻率低于0.03的單倍型其分布差異不予分析；并用該軟件進一步分析IL-10 -592A/C和-1082G/A位點單倍型與PTB-DM易感性的相關性。

結 果

一、基因多態性位點分型鑒定結果

IFN-γ+874A/T、IL-10-592A/C、IL-10-1082G/A位點經PCR擴增和基因多態性位點分型鑒定，獲得本次研究對象等位基因(分別為A、T，A、C、G、A)和基因型(分別為AA、AT、TT，AA、AC、CC、GA、AA)的構成情況，為后續共患疾病易感性相關性的分析提供等位基因和基因型范圍。各組IL-10 -1082G/A位點可能的基因型有GG、GA、AA等3種，但GG基因型在3個組的研究對象中均未檢測到。

二、Hard-Weinberg 遺傳平衡檢驗

對3個組研究對象各位點基因型分布進行Hard-Weinberg 遺傳平衡檢驗，顯示IFN-γ+874A/T位點上PTB組不符合Hard-Weinberg遺傳平衡(χ2=6.700，P=0.009)，而DM組和PTB-DM組該位點上均符合遺傳平衡(P值均>0.05)；IL-10 -592A/C和IL-10 -1082G/A位點上3個組均符合Hard-Weinberg遺傳平衡(P值均>0.05)，見表1。

三、單個SNP位點與PTB-DM易感性相關性分析

1.各位點等位基因頻率與PTB-DM易感性相關性分析：3個組的研究對象在IFN-γ +874A/T、IL-10 -592A/C、IL-10 -1082G/A等3個位點的A等位基因頻率差異均無統計學意義(P值分別為0.750、0.135、0.130)。進一步兩兩比較，在IFN-γ +874A/T和IL-10 -592A/C 2個位點上，PTB-DM組和PTB組、PTB-DM組和DM組之間等位基因頻率比較，差異均無統計學意義(P值均>0.05)；在IL-10 -1082G/A位點上，PTB-DM組和PTB組A等位基因頻率比較，差異無統計學意義(P=0.146)，而PTB-DM組和DM組等位基因頻率差異有統計學意義(P=0.046)，見表2。

表1 各位點基因型在不同組中的Hard-Weinberg檢驗情況

注預期頻數為根據平衡公式求得的平衡狀態時的理論頻數，觀察頻數為樣本中實際頻數，可能會出現基因位點檢測不到，導致頻數少于患者例數。理論值與實際值完全一致時，認定為平衡群體；如不一致，則通過卡方檢驗判斷其在兩組間的分布是否有差異，以P>0.05界定來自平衡群體

2.各位點基因型頻率與PTB-DM易感性相關性分析：在IFN-γ +874A/T、IL-10 -592A/C、IL-10 -1082G/A 3個位點上，三組間的基因型頻率差異均無統計學意義(P值均>0.05)，詳見表3。

3.logistic回歸分析：校正年齡和性別對結果的影響后，在PTB-DM組與PTB組、PTB-DM組與DM組間，以是否發生共患為因變量，以各種基因模型為自變量，對PTB-DM組與PTB組、DM組位點基因型頻率分別進行logistic回歸分析。結果顯示，PTB-DM組與PTB組的IFN-γ +874A/T、IL-10 -592A/C、IL-10 -1082G/A位點基因型頻率的差異均無統計學意義；PTB-DM組與DM組間IFN-γ +874A/T、IL-10 -592A/C位點基因型頻率差異無統計學意義，但與IL-10 -1082G/A位點基因型頻率差異存在統計學意義，在DM組患者中，基因型為AA的患者發生PTB-DM的風險是基因型為GA患者的 1.970倍(aOR=1.970；95%CI: 1.066～3.643)，見表4。

表2 研究對象各類等位基因在各組中發生頻率的比較

注a：PTB-DM 組、PTB 組、DM 組三組比較；b：PTB-DM 組與 PTB 組比較；c：PTB-DM 組與 DM 組比較

表3 研究對象各類基因型在各組中發生頻率的單因素分析

表4 研究對象各類基因型在各組中發生頻率的多因素logistic回歸分析

注表中“-”為無檢驗數據

四、基因內多態性位點之間的關聯情況

1.連鎖不平衡分析結果：在PTB-DM組及PTB組、DM組中，IL-10 -592A/C和IL-10 -1082G/A位點間存在連鎖不平衡(D′=0.959，r2=0.181，P<0.001)。

2.單倍型分析結果：運用單倍型分析軟件估計IL-10 -592A/C和IL-10 -1082G/A位點單倍型頻率，并分別比較PTB-DM組和PTB組、PTB-DM組和DM組之間單倍型頻率分布，結果顯示，本次研究人群中，IL-10 -592A/C和IL-10 -1082G/A位點共存在4種單倍型，分別為A-A、A-G、C-A、C-G，在3個組中的出現頻率均超過3%的單倍型組合(組內頻率>0.03)為A-A、C-A、C-G；A-G可能低于最低頻率閾值0.03，本研究中不予分析其分布差異。

PTB-DM組、PTB組、DM組的A-A、C-A、C-G單倍型頻率分布詳見表5、6，PTB-DM組和PTB組的3種單倍型頻率差異均無統計學意義；PTB-DM組和DM組的A-A、C-G單倍型頻率差異也均無統計學意義，但C-A單倍型頻率差異有統計學意義。

討 論

研究表明，TB患者罹患DM的可能性比正常人群更高，可導致TB病情遷延不愈，傳染性難以控制，嚴重威脅公共衛生安全和人群健康；而DM患者對TB的易感性也大大增加，共患可使DM患者病情加重，血糖控制難度增加，并發癥風險增高，顯著增加了糖尿病的醫療負擔和社會經濟成本[2-3]。故認為DM患者是預防TB發生的重要靶向人群，在DM患者中積極預防TB的發生，一方面可以在一定程度上減緩TB疫情的發展和蔓延，另一方面也有利于降低DM和TB的病死率[4]。本研究通過研究IFN-γ和IL-10基因位點多態性與PTB和DM易感性的關系，了解遺傳因素在疾病共患機制中的作用，為日后基于基因多態性的共患高危人群篩查提供科學依據。

表5 IL-10 基因單倍型頻率在PTB-DM組與PTB組間的比較

注“頻數”為頻率×總體個數得到的預期數，為軟件估算得到；“-”指A-G可能低于最低頻率閾值0.03，本研究中不予分析其分布差異

表6 IL-10 基因單倍型頻率在PTB-DM組與DM組間的比較

注“頻數”為頻率×總體個數得到的預期數，為軟件估算得到；“-”指A-G可能低于最低頻率閾值0.03，本研究中不予分析其分布差異

一、細胞因子基因單個SNP位點與PTB-DM易感性的相關性分析

基因位點多態性是由于等位基因之間在特定的位點上DNA序列存在差異，即基因組中散在堿基不同，單個堿基的置換又稱為SNP，是基因多態性的一種形式[15]。IL-10是一類重要的免疫調節細胞因子，主要由活化的T細胞、單核細胞、B細胞和胸腺細胞產生。既往針對IL-10基因位點多態性與疾病易感性的研究結果顯示，IL-10的-1082G/A位點、-819C/T位點和 -592A/C位點被證明與多種疾病有關，如肝硬化[16]、甲狀腺癌[17]、白血病[18]等，當然也包括TB和DM。但目前針對PTB-DM的基因位點多態性的研究尚十分稀少，僅有Garcia-Elorriaga 等[19]在2013年對21例PTB-DM患者、77例TB患者和60名健康對照者進行IL-10 -1082G/A位點和-592C/A位點的基因型檢測后發現，PTB-DM患者的IL-10 -592AA和IL-10 -592CC 基因型頻率均明顯高于健康對照者，而IL-10 -1082GG低于健康對照者，提示IL-10基因多態性可能與PTB-DM易感性有關。但該研究樣本量過小、健康對照定義不夠明確、對照組的年齡與患者組并不匹配等，導致結論的科學性較局限。

本次研究發現，IL-10 -1082G/A位點等位基因和基因型頻率分布在PTB-DM患者及DM患者中差異均有統計學意義，PTB-DM組-1082G/A位點A等位基因頻率高于DM組，其AA基因型在PTB-DM患者中的頻率明顯高于DM患者，該位點表現為AA基因型的DM患者對于TB的易感性是表現為GA基因型患者的1.970倍 (95%CI: 1.066～3.643)，提示IL-10 -1082位點的AA基因型可能與PTB-DM易感性有關，為疾病共患的危險因素。同時，PTB-DM與DM患者相比，IL-10 -592A/C位點等位基因頻率和基因型頻率差異均無統計學意義，提示在DM患者中，IL-10 -592A/C位點的SNP可能與其易感TB無關；PTB-DM患者與PTB患者相比，IL-10 -1082G/A位點、IL-10 -592A/C位點的等位基因頻率和基因型頻率差異也均無統計學意義，提示在PTB患者中，IL-10 -1082G/A位點、IL-10 -592A/C位點的SNP可能與其易感DM無關。以上陰性結果與Garcia-Elorriaga等[19]的研究結果不一致，該研究報道了共患患者和健康人群間的SNP和易感性的關聯，而本研究側重的是共患患者分別與PTB、DM之間的關聯，可能是關注點的不同導致了一些結果上的差異；還可能與樣本量大小、研究人種、研究對象的選擇、實驗方法的不同有關，有待下一步更大樣本的研究進一步證明。另外，本研究中只對年齡和性別進行了控制，未對更多相關因素進行考慮，該局限性可能導致基因多態性與疾病易感性之間的相關性產生一定偏移。本研究未對不同類別糖尿病進行入組限制，由于我國90%為Ⅱ型糖尿病患者[20]，故本研究結論適用于肺結核并發Ⅱ型糖尿病患者人群，對其他人群的外推性受到一定程度限制。

IFN-γ是另一類在機體免疫過程中扮演重要角色的細胞因子，對于調節結核分枝桿菌感染后機體的固有免疫和適應性免疫有重要作用。在既往研究中，IFN-γ +874A/T位點和CA repeats 12/non-12位點均被證明與多類疾病易感性有關，其中包括TB和DM。在西班牙[21]、南非[22]、中國[23]患者中，IFN-γ +874A/T位點的AA基因型均被證明增加了罹患TB的風險；在波蘭[24]兒童、 希臘[25]患者中IFN-γ +874A/T位點的A等位基因被證明是DM的易感因素，但既往尚無針對PTB-DM患者的相關基因多態性研究。本次研究中，創新性地探索了IFN-γ +874A/T位點與PTB-DM易感性是否存在相關性。結果顯示，IFN-γ +874A/T 位點的等位基因頻率和基因型分布在PTB-DM組、PTB組、DM組中差異均無統計學意義，提示IFN-γ +874A/T位點可能與DM患者易感TB無關，也與TB患者易感DM無關。由于該位點與疾病共患易感性相關性是首次進行研究，相關文獻報道較少，有待進一步大樣本的研究證明。

二、細胞因子基因內位點單倍型頻率與PTB-DM易感性的相關性分析

既往研究中對于復雜疾病相關基因進行定位的方法主要有兩大類，一類是進行基于家系數據(即親本到子代的數據)的多位點連鎖分析，另一類則是基于人群數據的單倍型分析；當致病基因的效應相對較弱時，一般在研究中采用單倍型的關聯分析[26]。本次研究發現，IL-10 -592A/C和IL-10 -1082G/A位點間存在連鎖不平衡，在此基礎上進一步分析IL-10單倍型與PTB-DM易感性的相關性，發現C-A 單倍型能增加DM患者共患TB的風險(OR=1.590，95%CI:1.056～2.396)。而C-A單倍型中IL-10 -1082G/A位點表現為A等位基因，也與前文基因型中相關發現一致，進一步說明了IL-10 -1082G/A位點可能與PTB-DM易感性有關。

三、共患患者IL-10 -1082G/A和-592A/C位點等位基因和基因型頻率的差異

本次研究中發現，在PTB-DM患者人群中，IL-10 -1082G/A位點和-592A/C位點的等位基因和基因型頻率隨國家地域分布和種族不同而有所差異。在針對墨西哥人群的相關研究中，IL-10 -592A/C位點的AA基因型在PTB-DM人群中僅占5%，而CC基因型占總患者例數的52%[19]；但在本次研究中，共患患者IL-10 -592A/C位點的AA基因型和CC基因型的頻率分別為44.37%和9.86%，與其分布相差較大。同樣，墨西哥人群中PTB-DM患者IL-10 -1082G/A位點的AA和GG基因型頻率均為29%[19]，而本次研究中，共患患者的AA基因型頻率為85.21%，GG基因型甚至并未檢測到，提示在不同人群種族中其本身的基因SNP的表現并不相同。也與此前王牡丹等[27]對我國浙南地區健康人群的IL-10基因啟動子區的多態性研究結果類似。本研究未檢測到GG基因考慮與人種差異有關。

綜上所述，對基因多態性的研究有助于從免疫學的角度理解PTB共患DM的發生、發展規律，探索攜帶不同等位基因的個體對共患疾病的易感性，為早期篩查、早期治療提供可能性。本次研究中發現的PTB-DM易感性的相關基因多態性位點尚是冰山一角，我們相信存在更多基因的SNP與兩類疾病的共患易感性有關，而此類基因及其多態性尚需要更多的研究證明。