新型膠顆粒芯片技術檢測痰標本中結核分枝桿菌及其耐藥性的研究

蘇丹 李強 車南穎 歐喜超 趙冰 趙雁林 黃海榮

結核病(TB)是全球第九大致死疾病，是由結核分枝桿菌復合群(MTBC)引起的一種嚴重危害人類健康的傳染性疾病。據世界衛生組織[1]報告僅2016年全球就有1040萬例新發肺結核患者，其中有49萬例耐多藥結核病患者，耐多藥結核病仍然是全球重大公共衛生危害之一。因此，及早正確診斷結核病及耐多藥結核病對于治療和預防這種高度傳染性疾病具有非常重要的意義。

傳統的細菌學檢查方法如萋-尼(Z-N)染色鏡檢的敏感度較低(60%)[2]，容易對患者造成漏診；BACTEC MGIT 960快速液體培養系統(簡稱“MGIT 960”)液體培養試驗需要1～2周的時間才能報告結果，同時液體培養試驗對實驗室硬件和人員能力也都有較高的要求[3-4]，限制了該方法的廣泛推廣應用。通過傳統的培養技術檢測結核分枝桿菌耐藥性，耗時較長(約2～3個月)，不能滿足臨床醫生對患者及時診斷、早期合理治療的需要。近些年隨著分子生物學技術的不斷發展，越來越多的分子檢測技術可有效檢測痰標本中的結核分枝桿菌及其耐藥性，檢測方便快捷且敏感度較高。新型膠顆粒芯片為低密度膠顆粒芯片，突破了一般芯片二維界面的局限性，通過提供三維反應空間，使得在新型膠顆粒芯片上可以進行更加有效的分子間反應，同時每個膠顆粒里可以裝載不同的反應試劑，更加靈活[5-6]。新型膠顆粒芯片技術[TruArray膠顆粒芯片(Gel element arrays)，簡稱為“TruArray芯片”]用于結核分枝桿菌耐藥性檢測，通過檢測最常見的rpoB和katG/inhA耐藥基因是否突變，確定結核分枝桿菌對利福平和異煙肼的耐藥性，可以在6 h內自動報告檢測結果[7]。本研究通過該方法檢測149例疑似肺結核患者痰標本，檢測是否含有結核分枝桿菌及其對利福平和異煙肼的耐藥性，初步分析該技術的檢測效能，探討其在我國臨床結核病實驗室的推廣應用價值。

對象和方法

一、研究對象和試劑

1．研究對象：選取2016年8月在首都醫科大學附屬北京胸科醫院就診的所有疑似肺結核患者，共149例，提供149份痰標本。

2. 試劑：TruDx 2100 試劑盒購自美國Akonni公司，GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)試劑盒購自美國Cepheid公司，MGIT 960液體培養管和藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)檢測試劑盒均來自美國BD公司。

二、研究方法

1．痰標本處理：痰標本采用N-乙酰-L半胱氨酸-NaOH(NALC-NaOH)消化液處理，使用磷酸鹽緩沖液中和并離心(3000×g、8～10 ℃ 離心15～20 min)后，傾倒磷酸鹽緩沖液并重懸菌液沉淀至2 ml，分裝2份分別進行MGIT 960快速液體培養和GeneXpert檢測。

2．MGIT 960培養法和藥敏試驗：加入0.5 ml處理后的痰標本至MGIT 960培養管(含0.8 ml OADC營養添加劑和抑菌劑)中進行培養，孵育42 d，實時監測并讀取結果[3-4]。對培養陽性鑒定為MTBC的菌株，按照操作手冊要求將其加入含有利福平(1 μg/m1)和異煙肼(0.1 μg/m1)藥物的培養管中，進行利福平和異煙肼的耐藥性檢測[8-9]。

3. GeneXpert檢測：將GeneXpert試劑盒配套的處理液加入到含有NALC-NaOH處理后痰標本的離心管中，渦旋振蕩后靜置15 min，將處理后樣品由加樣孔緩慢加入到反應盒內。然后上機，反應2 h后讀取結果[8,10]。

4．TruArray芯片檢測：使用TruTip純化裝置和TruPrep自動化樣本制備儀(Akonni Biosystems)進行核酸提取和純化，每次運行能夠同時處理8個樣品。取40 μl液化緩沖液加入到500 μl痰標本中并在56 ℃的水浴中加熱20 min，將液化的樣品轉移到樣品裂解管，隨后將樣品裂解管放入自動化樣本制備儀，通過軟件啟動程序運行，核酸提取自動完成后，吸取16.8 μl DNA與63.2 μl制備的MTB多重PCR反應液(Akonni)混合，然后將裝載的微陣列置于Bioer GeneTouch平板熱循環儀(杭州博日科技有限公司)上，并進行以下擴增和雜交程序：30個循環的降落PCR(第1個循環，89 ℃變性45 s，60 ℃退火1 min，第30個循環為55 ℃退火)，在65 ℃進行30 s延伸，20個循環的PCR(89 ℃變性45 s，55 ℃退火60 s和65 ℃延伸30 s)，最終55 ℃雜交3 h。雜交后，用1000 μl雜交洗滌緩沖液洗滌微陣列，然后離心(200×g、離心1 min)以干燥微陣列。使用具有自動軟件分析的TruDx?成像儀對干燥的微陣列成像，儀器自動報告結果。

5．測序：采用16S rRNA基因測序對液體培養陽性菌株進行結核分枝桿菌菌種鑒定，rpoB基因測序用于利福平耐藥基因檢測，katG和inhA基因測序用于異煙肼耐藥基因檢測。擴增產物由天一輝遠生物技術有限公司進行單向測序，序列提交至美國國立生物技術信息中心(NCBI)網站(http://blast.Ncbi.nlm．nih．gov/Blast.cgi)做同源性比較或多序列比對，引物序列見表1。

表1 菌種鑒定及耐藥基因測序引物序列

三、統計學處理

采用SPSS 22.0軟件對結果數據進行統計學處理，計算敏感度和特異度，評價新型膠顆粒芯片技術檢測對結核分枝桿菌、利福平和異煙肼耐藥性的檢測效能。各種檢測方法的檢出率比較采用配對卡方檢驗(McNemar test)，以P<0.05為差異有統計學意義。通過Kappa一致性檢驗，對TruArray芯片與耐藥基因測序檢測利福平和異煙肼耐藥的一致性進行比較，Kappa值>0.75代表一致性好。

結 果

一、MGIT 960液體培養、GeneXpert和TruArray芯片對結核分枝桿菌檢出率的比較

149份痰標本中，54份標本MGIT 960液體培養陽性，6株培養陽性菌株經測序鑒定為非結核分枝桿菌(5株為胞內分枝桿菌，1株為堪薩斯分枝桿菌)，液體培養對結核分枝桿菌的陽性檢出率為32.2%(48/149)；81份標本GeneXpert結核分枝桿菌檢測陽性，1份GeneXpert檢測陽性標本經測序鑒定為胞內分枝桿菌，GeneXpert對結核分枝桿菌的陽性檢出率為53.7%(80/149)；86份標本TruArray 芯片結核分枝桿菌檢測陽性，1份TruArray 芯片檢測陽性標本經測序鑒定為胞內分枝桿菌，TruArray芯片對結核分枝桿菌的陽性檢出率為57.0%(85/149)。TruArray芯片和GeneXpert兩種方法陽性檢出率差異無統計學意義(χ2=0.34，P=0.560)，但TruArray芯片檢測陽性檢出率高于液體培養(χ2=18.59，P<0.01)。

二、 TruArray芯片對痰標本中結核分枝桿菌的檢測

以MGIT 960液體培養聯合測序鑒定結果為標準，TruArray芯片檢測痰標本中結核分枝桿菌的敏感度和特異度分別為97.9%(47/48)和61.4%(62/101)。以GeneXpert檢測聯合測序結果為標準，TruArray芯片檢測結核分枝桿菌的敏感度和特異度分別為97.5%(78/80)和88.4%(61/69)(表2)。

三、 TruArray芯片檢測痰標本中結核分枝桿菌對利福平的耐藥性分析

共對48株分離的結核分枝桿菌菌株進行MGIT 960液體藥敏試驗，5份標本TruArray芯片利福平耐藥檢測失敗，以液體藥敏試驗結果為標準，TruArray芯片檢測利福平耐藥的敏感度和特異度分別為91.7%(11/12)和96.8%(30/31)。81份GeneXpert檢測陽性標本，2份標本GeneXpert利福平耐藥檢測失敗，11份標本TruArray芯片利福平耐藥檢測失敗，以GeneXpert檢測結果為標準，TruArray芯片檢測利福平耐藥的敏感度和特異度分別為85.0%(17/20)和97.9%(47/48)。對43株分離培養的結核分枝桿菌菌株進行rpoB耐藥基因測序，與測序結果比較，TruArray芯片檢測利福平耐藥的敏感度和特異度分別為92.3%(12/13)和100.0%(30/30)(表3)，TruArray芯片利福平耐藥檢測與rpoB耐藥基因測序結果的一致性較高(Kappa值=0.9)。

表2 TruArray芯片檢測MTB的效能

注敏感度=真陽性數/(真陽性數+假陰性數)×100%；特異度=真陰性數/(真陰性數+假陽性數)×100%

表3 TruArray芯片檢測MTB對利福平耐藥的效能

注敏感度=真陽性數/(真陽性數+假陰性數)×100%；特異度=真陰性數/(真陰性數+假陽性數)×100%

四、 TruArray芯片檢測痰標本中結核分枝桿菌對異煙肼的耐藥性分析

共對48株分離的結核分枝桿菌菌株進行液體藥敏試驗，2份標本TruArray芯片異煙肼耐藥檢測失敗，以液體藥敏試驗結果為標準，TruArray芯片檢測異煙肼耐藥的敏感度和特異度分別為78.6%(11/14)和93.8%(30/32)。對46株分離培養的結核分枝桿菌菌株進行katG和inhA耐藥基因測序，與測序結果比較，TruArray芯片檢測異煙肼耐藥的敏感度和特異度分別為100.0%(11/11)和94.3%(33/35)，TruArray芯片異煙肼耐藥檢測與katG和inhA耐藥基因測序結果的一致性較高(Kappa值=0.9)(表4)。

討 論

目前，越來越多的新檢測技術可進行結核病及耐藥結核病的早期診斷和鑒定，每種檢測技術各有利弊[11-12]。本研究評估的新型膠顆粒芯片技術，通過使用自動化核酸提取方法，將常規的核酸提取步驟(裂解、吸附、洗脫)整合在一個吸頭上，4 min內完成DNA核酸樣品的快速提取，操作簡單方便。通過使用全自動移樣器還可進行核酸樣品的批量提取，實現樣品準備工作的快速和自動化[13]。TruArray芯片中的每個膠顆粒都是一個獨立的生物傳感器并能支持獨立的化學反應，并在密封芯片內集成了擴增、雜交、洗脫、熒光讀取等功能。由于芯片的密封性和高集成性，降低了擴增產物污染，保證結核分枝桿菌及耐藥檢測結果準確可靠。本研究結果表明，TruArray芯片對痰標本中結核分枝桿菌的檢出率高于液體培養試驗，以液體培養試驗聯合測序鑒定結果為標準，TruArray芯片檢測結核分枝桿菌的特異度僅為61.4%。由于TruArray芯片以及GeneXpert檢測和其他分子檢測一樣，僅能檢測結核分枝桿菌的DNA，檢測陽性不能區分是活菌還是死菌，但液體培養陽性能證明標本中有活菌存在；本研究液體培養陽性率較低，可能由于筆者使用凍存的痰標本，降低了分離培養的陽性率。

表4 TruArray芯片檢測MTB對異煙肼耐藥的效能

注敏感度=真陽性數/(真陽性數+假陰性數)×100%；特異度=真陰性數/(真陰性數+假陽性數)×100%

GeneXpert檢測是世界衛生組織推薦的結核分枝桿菌分子生物學檢測方法，有大量研究表明該方法可以簡單快速地診斷結核病及利福平耐藥結核病[10]。本研究證明，TruArray芯片與GeneXpert檢測效能相當，實驗中發現1份GeneXpert結核分枝桿菌檢測陽性標本經測序鑒定為胞內分枝桿菌，GeneXpert檢測結果為極低，利福平耐藥檢測結果為敏感；另有1份TruArray芯片結核分枝桿菌檢測陽性標本經測序鑒定也為胞內分枝桿菌，利福平和異煙肼耐藥檢測失敗，兩份標本均涂片鏡檢陽性，推測可能是由于所檢樣本為結核分枝桿菌和胞內分枝桿菌混合感染，但胞內分枝桿菌所占比例較高且報告時間較早，導致培養試驗僅分離出胞內分枝桿菌所致。

對于TruArray芯片結核分枝桿菌檢測陽性的標本，還可進一步檢測其對利福平和異煙肼的耐藥性，而目前GeneXpert檢測僅能對利福平的耐藥性進行檢測，以液體藥敏試驗結果為標準，TruArray芯片檢測利福平耐藥的敏感度和特異度分別為91.7%和96.8%，與耐藥基因測序結果比較，TruArray 芯片檢測利福平耐藥的敏感度和特異度分別為92.3%和100.0%， TruArray芯片利福平耐藥檢測與rpoB耐藥基因測序結果的一致性較高。以液體藥敏試驗結果為標準，TruArray芯片檢測異煙肼耐藥的敏感度和特異度分別為78.6%和93.8%，造成敏感度較低的原因，可能是由于該檢測方法僅檢測兩個主要的異煙肼耐藥相關基因，分別是katG和inhA基因，這2個基因與異煙肼耐藥相關性僅為70%左右[14]，通過與耐藥基因測序結果比較，檢測敏感度和特異度分別為100.0%和94.3%。同時，本研究發現目前TruArray芯片檢測利福平耐藥的失敗率較高(18.6%,16/86)，為進一步提升TruArray芯片檢測結果的穩定性及異煙肼耐藥檢測的敏感度，還需要進一步優化反應體系并增加相關異煙肼耐藥基因的檢測。

綜上所述，TruArray芯片檢測結核分枝桿菌的敏感度和特異度較高、檢測周期短、操作相對簡單，同時可以準確檢測利福平和異煙肼的耐藥性，對結核病、尤其是耐多藥結核病的早期診斷和治療具有十分重要的意義。