不同花色白芨四種DNA條形碼的序列分析

曾麗娜 劉顯義 石建龍

摘要：采用CTAB法提取2種花色白芨基因組DNA，選用trnH-psbA、rbcL、ITS、LSU D1-D3 4種植物DNA條形碼通用引物進行PCR擴增，分析黃花、紫花白芨（Bletilla striata）4種DNA條形碼的序列，擴增產物純化后連接T載體并測序，用DNAMAN軟件對測序結果進行多序列比對分析。再根據SNP位點設計引物，利用位點特異性PCR擴增進行鑒定。結果表明，4對植物DNA條形碼通用引物均能進行擴增，其中trnH-psbA序列沒有發現SNP位點、rbcL序列出現2個SNP位點、ITS序列出現62個SNP位點、LSU D1-D3序列出現3個SNP位點。根據LSU D1-D3序列上的2個SNP位點設計的引物DUAN5（5′-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3′）和JDHH（5′-TTATCAGCTTCCTTGCGCCCG-3′）能準確鑒定出黃花白芨，成功獲得鑒定黃花白芨的引物序列。

關鍵詞：白芨（Bletilla striata）；DNA條形碼；PCR；SNP

中圖分類號：R282 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）17-0106-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.17.027 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Genomic DNA was extracted from the two kinds of color of Bletilla striata by using the CTAB method. To analysis the sequence of different flower color of Bletilla striata based on the four kinds of DNA barcode for further identification. Four DNA barcoding markers（trnH-psbA，rbcL，ITS and LSU D1-D3） were selected for PCR. PCR product was ligated into T vector for sequencing. The sequencing results were analyzed by using DNAMAN software. According to the SNP loci of different color of Bletilla striata， the primers were designed for identifying different color of Bletilla striata. Result showed that：two kinds of flower color of Bletilla striata genomic DNA can be amplified based on 4 pairs primers of plant DNA barcode markers and SNP loci were found. None SNP locus was found in trnH-psbA sequence. Two SNP loci were found in rbcL sequence. Sixty-two SNP loci were found in ITS sequence. Three SNP loci were found in LSU D1-D3 sequence. Primer DUAN5（5′-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3′） and JDHH（5′-TTATCAGCTTCCTTGCGCCCG-3′） can be used for identifying the yellow flower color of Bletilla striata according to the SNP loci in LSU D1-D3 sequence. The primers were found for identifying the yellow flower color of Bletilla striata.

Key words： Bletilla striata； DNA barcode； PCR； SNP

白芨（Bletilla striata）為蘭科（Corchidaceae）白芨屬（Bletilla）多年生草本植物，是中國重要的中藥材。商品白芨為白芨屬白芨假鱗莖制成的干燥塊莖，性平味苦，具有斂氣、滲痰、止血、消腫等功效，主要用于治療咳血、吐血、外傷出血、潰瘍病出血等。白芨屬植物全世界共有6種，其中中國有4種，即華白芨（Bletilla sinensis）、小白芨（Bletilla formosana）、白芨（Bletilla striata）和黃花白芨（Bletilla ochracea）[1]。主要分布在貴州、廣西、安徽、四川、云南、陜西和湖北等地，其中以貴州、廣西、湖北、安徽野生種質資源分布最為豐富。

由于白芨種子發育不完全，常規條件下很難發芽。近年來，隨著藥理研究的深入，市場需求強勁增長，人們瘋狂采挖野生資源，導致野生白芨資源急劇減少。為滿足日益增長的市場需求，白芨組培快繁技術與直播技術相繼研發成功[2-5]，全國各地掀起白芨人工種植熱潮。但是，用于繁育種苗的白芨果莢均沒有經過品種選育，而是采集于野生白芨資源。于是，在白芨種植基地中普遍出現黃花、白花、紫花白芨混雜的情況，大大影響藥材安全。《中國藥典》規定藥用的主要為紫花三叉白芨，其他黃花、白花白芨等都是習用品和偽品。為此，迫切需要研發能在幼苗或種莖時對黃花、白花、紫花白芨進行快速鑒定的方法。

有關白芨屬植物的鑒定，已有從形態學、化學成分以及ISSR、RAPD等DNA分子標記方面的報道[6-8]， 這些研究都為白芨屬藥用植物的鑒定提供了依據。DNA條形碼的出現，為白芨屬藥用植物的鑒定帶來了新的思路。DNA條形碼技術（DNA barcode）是利用相對較短的標準DNA片段對物種進行快速、準確鑒定的一門技術。由加拿大分類學家Paul Hebert 在2003年首次提出，該技術可以從分子水平彌補傳統鑒定方法的一些不足。DNA條形碼技術優點：①具有不受生物個體形態特征限制，只需小部分材料就能準確鑒別大多數物種。②鑒定結果不受個體生長發育階段影響，從而加快鑒定進程。③準確性高。一個好的DNA條形碼應符合的條件：①在種內種間需要有明顯的遺傳變異和分化，同時種內變異足夠小。②片段足夠短，便于一個反應完成測序工作，而且便于DNA提取，滿足PCR擴增，尤其是對存在DNA降解的材料。③存在保守區域，便于設計通用引物。DNA條形碼技術具有較好的通用性，只需選用一個或少數幾個基因片段就可快速有效地鑒別物種，而且該技術操作簡便，具有較好的重復性和穩定性，目前已得到廣泛的應用。2014年，基于ITS2+trnH-psbA片段組合的中藥材DNA條形碼鑒定系統已初步建成，它系統收錄了中國藥典以及日本藥局方、韓國藥典、美國藥典、歐洲藥典和印度藥典所記載的23 262個物種（包含了95%以上的草藥藥材），共計78 847條DNA條形碼序列[9]。中國醫學科學院完成了8 000余種中草藥白芨其混偽品的DNA條形碼研究，創建了“中藥材DNA條形碼生物鑒定體系”。驗證發現約220 bp的核基因組序列ITS2具有良好的鑒定效率，特別適合中藥材等存在DNA降解的材料。該序列明顯優于國際生命條形碼聯盟推薦的400～800 bp葉綠體序列rbcL和matK聯合條形碼。trnH-psbA、rbcL、matK、ITS、ITS2、LSU D1-D3 6種DNA條形碼常用于藥用植物的物種鑒定[10]。

2014年，吳勁松等[11]選用nrDNA ITS、LFY同源基因內含子2、葉綠體ycf1基因3種DNA條形碼對白芨屬藥用植物進行了研究，研究結果表明，nrDNA ITS和ycf1序列可以作為白芨屬及其混偽品鑒定用的DNA條形碼。

單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP），是指在基因組水平上由于單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。本試驗通過對黃花白芨、紫花白芨的trnH-psbA、rbcL、ITS、LSU D1-D3序列進行分析，并針對分析發現的SNP位點3′末端的堿基設計特異性擴增引物，優化PCR擴增體系，以期能準確鑒別黃花白芨和紫花白芨。

1 材料與方法

1.1 材料

采自貴州遵義市白芨種植基地的黃花白芨和紫花白芨，并經貴州醫科大學生藥學教研室龍慶德教授鑒定。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 各取黃花白芨、紫花白芨100 mg嫩葉，采用CTAB法提取其全基因組DNA。操作步驟參照《基因工程實驗教程》中的植物組織基因組DNA的提取部分，略有改動。基因組DNA用TE溶液溶解后，用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，其余保存于冰箱-20 ℃。

1.2.2 PCR擴增 選用文獻[10]中trnH-psbA、rbcL、ITS、LSU D1-D3 DNA條形碼的擴增引物進行PCR擴增，擴增引物見表1。使用梯度PCR儀摸索反應條件和擴增。擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，熒光成像系統拍照保存。用回收試劑盒對特異目的條帶進行回收純化。

1.2.3 PCR產物連接T載體與測序 按照T載體使用說明將回收的目的片段與T載體進行連接，熱擊轉化DH5α感受態細胞，依據藍白斑篩選重組轉化子。

1.2.4 重組轉化子的鑒定 挑選白色菌落接種于3 mL LB液體培養基中，37 ℃，200 r/min培養12～16 h。利用M13通用引物對菌液進行擴增，產物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.5 測序、序列比對分析 將鑒定正確的重組轉化子菌液送北京華大基因有限公司測序。用DNAMAN軟件對測序結果進行拼接、序列比對，分析黃花、紫花白芨的序列差異。

1.2.6 SNP位點確認、引物設計及PCR驗證 根據序列分析發現的SNP位點設計引物，設計主要依據3′端堿基要嚴格配對的原則。采用梯度PCR儀摸索擴增反應條件。利用該條件進行重復3次的PCR擴增，3次擴增結果一致，則認為該SNP位點真實存在，可用于鑒定。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA抽提

采用CTAB法分別抽提黃花白芨、紫花白芨基因組DNA。經紫外分光光度計進行檢測，所提DNA吸光度值A260 nm/A280 nm比值均在1.8～2.0，無蛋白質等污染。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果如圖1所示，所得條帶清晰，無拖尾現象，可滿足擴增要求。

2.2 4種DNA條形碼通用引物的PCR擴增

根據梯度PCR預試驗結果，確定4種DNA條形碼擴增退火溫度分別為ITS 47 ℃，LSU D1-D3 56 ℃，trnH-psbA為58 ℃，rbcL為55 ℃。4種DNA條形碼擴增序列長度分別為ITS序列762 bp，LSU D1-D3序列760 bp，trnH-psbA序列約896 bp，rbcL序列598 bp，PCR擴增電泳檢測結果如圖2所示。4種DNA條形碼均能擴增出相應大小的特異條帶。

2.3 擴增產物與T載體連接、轉化及重組子鑒定

將特異PCR產物進行回收，并與T載體進行連接，然后熱擊轉化、涂板。培養過夜后，挑選白色菌落進行培養。選用T載體上的M13通用引物進行重組子的鑒定，其中rbcL重組子鑒定電泳結果見圖3。第1、2、3泳道的M13引物PCR擴增產物大于第4泳道的rbcL通用引物擴增產物，顯示連接成功。將鑒定連接好的重組子菌液送北京華大基因有限公司測序。

2.4 序列分析

用DNAMAN軟件對測序結果作多序列比對分析，其中ITS序列總長762 bp，2種花色一致性91.87%，共有62個SNP位點，是4種DNA條形碼序列中SNP位點最多的序列；LSU D1-D3序列總長760 bp，2種花色一致性99.61%，3個SNP位點。rbcL序列總長598 bp，2種花色一致性99.67%，2個SNP位點；trnH-psbAF序列總長896 bp，2種花色一致性100%，序列完全一致。具體見表2和表3。

2.5 SNP位點確認及鑒定

根據LSU D1-D3序列636和641位點SNP設計引物，上游引物為DUAN5：（5′-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3′）；下游引物則根據3′端堿基要嚴格配對的原則進行設計，命名為JDHH，序列為5′-TTATCAGCTTCCTTGCGCCCG-3′。2個斜體G即為黃花白芨636和641位點的2個C，擴增產物大小約640 bp。利用梯度PCR儀摸索擴增條件，最佳退火溫度為54 ℃。擴增體系為30 μL體系中6 μL 5×Taq buffer，dNTPs 2.4 μL，1 μL引物（終濃度0.4 μmol/L），1 μL模板（終濃度約60 ng），Taq酶0.15 μL，ddH2O加至30 μL。PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，進行30個循環，72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。分別利用該反應程序對紫花白芨、黃花白芨進行擴增鑒定，結果3次重復試驗均獲得一致結果，即只有黃花白芨有相應擴增條帶，而紫花白芨沒有擴增產物，結果如圖4所示。表明這2個SNP位點真實存在，所設計的引物可用于鑒定黃花白芨。

3 討論

ITS、trnH-psbA、rbcL、LSU D1-D3 DNA條形碼已廣泛應用于多種物種的鑒定中。本試驗中，這4種DNA條形碼對紫花、黃花2種花色白芨均能進行PCR擴增，連接T載體后的測序結果也均能找到上下游引物。其中ITS是核糖體DNA的非編碼區，承受著較小的選擇壓力，因此ITS序列進化速度較快、變異較大，長度適中，常用于物種的鑒定[12]。黃花白芨、紫花白芨ITS序列分析結果也顯示，相比其他3種DNA條形碼，ITS序列差異最大，多達62個SNP位點。吳勁松等[11]的研究結果顯示，核基因nrDNA ITS和葉綠體基因ycf1序列均可作為白芨屬鑒定的有效DNA條形碼，并采用單片段nrDNA ITS或ycf1基因序列就能成功鑒定出白芨屬物種及其混偽品。

trnH-psbA序列是進化速率較快的葉綠體間隔區之一。trnH-psbA兩端有75 bp的保守區序列，為設計通用引物提供了較大的便利[13]。從各類DNA條形碼技術的報道和相關文獻來看，ITS序列和trnH-psbA序列適合鑒別種級的不同個體[14]，但本試驗結果卻發現黃花白芨和紫花白芨的trnH-psbA序列完全一樣，沒有差異，值得深入研究，即trnH-psbA序列不適合用于鑒別黃花白芨、紫花白芨。

rbcL基因為葉綠體基因，編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的大亞基。由于葉綠體DNA序列和結構的高度保守性[15]，rbcL基因的差異小，PCR擴增容易，在植物種屬鑒定中也得到了廣泛應用。2009年國際條形碼工作組提出matK+rbcL這兩個序列作為通用的條形碼序列[16]。黃花白芨與紫花白芨rbcL序列只存在2個SNP位點，且相距相對較遠，不適宜設計引物進行鑒定。

核糖體大亞基（LSU）DNA（rDNA）含有12個擴增片段（D1-D12），為用作條形碼提供選擇[17]。28S rDNA D1-D3（LSU D1-D3）已被廣泛用于鑒定藥用植物。LSU D1-D3序列的通用引物在黃花白芨、紫花白芨中均能進行有效擴增，序列分析發現存在3個SNP位點，而且其中有2個SNP位點隔得很近，非常適合設計引物用于鑒定。PCR結果也證明該位點真實存在，通過PCR條帶的有無就可鑒定黃花白芨和紫花白芨，出現條帶的為黃花白芨，沒有條帶的為紫花白芨。

SNP位點的解析是分析種間差異小的種群的一個重要手段[18]。本研究通過對紫花白芨、黃花白芨 ITS、trnH-psbA、rbcL、LSU D1-D3 DNA條形碼序列變異位點進行分析后，發現ITS、rbcL、LSU D1-D3 DNA條形碼在紫花白芨和黃花白芨間存在穩定的SNP位點，這些位點的存在使2種花色白芨相互鑒別成為可能。為了進一步驗證這些SNP位點的準確性，本研究就白芨藥材（紫花白芨）和黃花白芨LSU D1-D3 DNA條形碼序列的特異性位點設計引物，采用梯度PCR篩選最佳退火溫度，優化擴增條件。通過凝膠電泳檢測PCR擴增條帶的有無，就可將白芨藥材（紫花白芨）和黃花白芨進行鑒別。

參考文獻：

[1] 仇 碩，趙 健，唐鳳鸞，等.白芨產業的發展現狀、存在問題及展望[J].貴州農業科學，2017，45（4）：96-98.

[2] 和壽星，徐中志，薛潤光，等.白芨無菌播種育苗技術[J].云南農業科技，2010，39（6）：38-39.

[3] 張 燕，黎 斌，李汝娟，等.白芨種子的無菌萌發過程觀察和組培快繁研究[J].北方園藝，2013，40（3）：158-160.

[4] 石云平，趙志國，唐鳳鸞，等.白芨愈傷組織誘導、增殖與分化研究[J].中草藥，2013，44（3）：349-353.

[5] 史文旋，張躍進.白芨種子直播繁殖技術研究[J].北方園藝，2017（7）：160-165.

[6] 孫宇龍，侯北偉，耿麗霞，等.基于SRAP標記的白芨遺傳多樣性和遺傳結構評價[J].藥學學報，2016，51（1）：147-152.

[7] 和志嬌，呂麗芬，楊麗云，等.白芨種質資源遺傳多樣性的ISSR分析[J].西南農業學報，2008，21（4）：1081-1085.

[8] 陳 錦，楊侃侃，王志偉，等.利用RAPD、ISSR標記分析白芨種質資源遺傳多樣性的研究[J].中國農學通報，2017，33（12）：137-142.

[9] CHEN S L，PANG X H，SONG J Y，et al.A renaissance in herbal medicine identification：From morphology to DNA[J].Biotechnol Adv，2014，32（7）：1237-1244.

[10] 蔡金龍，謝世清，張廣輝，等.藥用植物DNA條形碼鑒定研究進展[J].植物科學學報，2017，35（3）：452-464.

[11] 吳勁松，張宇思，劉 薇，等.白芨屬藥用植物DNA條形碼的確立及其應用[J].藥學學報，2014，49（10）：1466-1474.

[12] 韓 奇，湯 健，王曉琴，等.基于DNA條形碼技術鑒別5種列當屬藥用植物[J].中國現代中藥，2017，19（7）：917-923.

[13] PANG X H，LIU C，SHI L C，et al.Utility of the trnH-psbA intergenic spacer region and its combinations as plant DNA barcodes：A meta-analysis[J].PLoS One，2012，7（11）：e48833.

[14] 閆化學，于 杰.DNA條形碼技術在植物中的研究現狀[J].植物學報，2010，45（1）：102-108.

[15] DONG W P，C HENG T，LI C H，et al.Discriminating plants using the DNA barcode rbcLb：An appraisal based on a large data set[J].Molecular Ecology Resources，2014，14（2）：336-343.

[16] HOLLINGSWORTH P M，FORREST L L，SPOUGE J L，et al.A DNA barcode for land plants[J].PNAS，2009，106（31）：12794-12797.

[17] 劉淑艷，張 傲，李 玉.菌物DNA條形碼技術的研究進展[J].華中農業大學學報，2012，31（1）：121-126.

[18] 趙 丹，周 濤，江維克，等.基于ITS2序列SNP位點鑒定白芨藥材芨其混偽品[J].中國中藥雜志，2015，40（18）：3573-3578.