上海市鼠傷寒沙門菌單相變異株的鑒定和耐藥譜分析

吳 雯，屠麗紅，張雯霞，張 曦，陳 敏

（1. 上海市疾病預防控制中心，上海 200336；2. 上海中醫藥大學附屬曙光醫院檢驗科，上海 201203）

鼠傷寒沙門菌是引起食物中毒最常見的致病菌之一，也是重要的醫院感染致病菌[1]。20世紀90年代中期，泰國、西班牙等國家首先報道分離出鼠傷寒沙門菌單相變異株，該單相變異株是從鼠傷寒沙門菌進化而來的[2-3]。單相變異株主要指Ⅱ相鞭毛抗原的缺失，可能的分子機制包括Ⅱ相鞭毛抗原編碼基因fljB缺失或相關的調控基因如fljA和hin等缺失導致其血清型由4，[5]，12：i：1，2變為4，12：i：-或4，5，12：i：-[4]。近年來，鼠傷寒沙門菌單相株在世界范圍內迅速流行、暴發，多重耐藥不斷加劇，引發了嚴重的公共衛生問題[5]。目前我國相關的報道較少，尚缺乏快速、有效的鑒定方法，故其流行情況、耐藥譜等長期被忽視和低估[6]。本研究擬以上海市疾病預防控制中心細菌檢測實驗室收集的上海市流行的沙門菌為研究對象，應用血清分型和分子生物學技術，鑒定鼠傷寒沙門菌單相變異株，探討其血清型、耐藥譜型和基因型特征。

1 材料和方法

1.1 菌株和試劑

1.1.1 菌株 沙門菌由上海市疾病預防控制中心細菌檢測實驗室從腹瀉患者糞便樣本中分離并保存，鼠傷寒沙門菌標準株（ATCC 202165）由上海市疾病預防控制中心菌毒種保藏中心保存。

1.1.2 試劑和培養基 沙門菌顯色培養基、水解酪蛋白胨培養基由上海市疾病預防控制中心培養基室配置。沙門菌診斷血清和誘導瓊脂購自丹麥國家血清研究所。抗菌藥物藥物敏感性紙片和水解酪蛋白胨瓊脂購自英國Oxoid公司，所有引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑Premix taq、DL 2000 DNA marker購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 鼠傷寒沙門菌單相株鑒定

將2013—2015年上海市疾病預防控制中心細菌檢測實驗室收集的1 179株沙門菌進行復蘇，分別進行PCR鑒定和血清分型。

1.2.1 PCR鑒定 采用煮沸裂解法獲取沙門菌核酸，PCR擴增鼠傷寒沙門菌及其單相變異株共有的特異性基因片段fliB-fliA基因間區，引物序列見表1。PCR反應體系為： 2×Premix taq 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板DNA 1 μL，用無菌雙蒸水補至25 μL。PCR反應條件見表1。擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。擴增片段大小為964 bp的菌株是鼠傷寒沙門菌，擴增片段缺失或大小不符為其他血清型沙門菌。

表1 引物序列和PCR反應條件

1.2.2 血清分型 采用玻片凝集實驗對菌株進行血清分型的復核，依據White-Kauffman-Le Minor抗原表，記錄完整的抗原式，將血清型為4，5，12：i：1，2或者4，12：i：1，2的菌株記錄為鼠傷寒沙門菌，對于連續誘導3次后仍然缺失Ⅱ相鞭毛抗原的鼠傷寒沙門菌，記錄血清型為4，5，12：i：-或4，12：i：-。 血清型符合4，[5]，12：i：- 且fliB-fliA基因間區擴增片段大小為964 bp的菌株為鼠傷寒沙門菌單相株，統計分析2013—2015年上海市鼠傷寒沙門菌單相變異株的流行特征。

1.3 鼠傷寒沙門菌單相株基因特征研究

以鼠傷寒沙門菌單相株的核酸為模板，以鼠傷寒沙門菌標準株（ATCC 202165）為陽性對照，PCR擴增fljA、fljB和hin基因，引物序列見表1。PCR反應體系為： 2×Premix taq 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板DNA 1 μL，用無菌雙蒸水補至25 μL，擴增產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。見表1。

1.4 藥物敏感性試驗

藥物敏感性試驗采用世界衛生組織推薦的改良紙片擴散法，依據2016年美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）指南進行操作和結果判讀。所選用的抗菌藥物包括頭孢西丁（cefoxitin，FOX）、頭孢噻肟（cefotaxime，CTX）、頭孢呋辛（cefuroxime，CXM）、慶大霉素（gentamicin，GN）、氨芐西林（ampicillin，AMP）、萘啶酸（nalidixic acid，NAL）、環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、左氧氟沙星（levofloxacin，LEV）、諾氟沙星（norfloxacin，NOR）、氯霉素（chloramphenicol，C）、四環素（tet racycli ne，TE）、鏈霉素（streptomycin，S）、磺胺異噁唑（sulfasoxazole，SF）和復方磺胺甲噁唑（sulfamethoxazoletrimethoprim，SXT）14種。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。耐藥率比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2013—2015年上海市鼠傷寒沙門菌單相變異株檢出情況

1 179株沙門菌中共分離出單相變異株52株，分別占所有沙門菌和鼠傷寒沙門菌的4.4%和23.3%。進一步分析這些單相變異株的宿主信息，發現31株（59.6%）單相變異株的宿主來源于15～60歲的青中年人群，9株（17.3%）來源于 0～15歲的少兒人群，12株（23.1%）來源于＞60歲的老年人群；宿主性別分析顯示28株（53.8%）檢出于男性，24株（46.2%）檢出于女性；地域分布信息分析顯示40株（76.9%）的宿主來源為上海郊區，12株（23.1%）的宿主來來源為上海市區。

2.2 鼠傷寒沙門菌單相株血清型特征和基因特征

血清分型結果顯示52株鼠傷寒沙門菌單相變異株的血清型均為4，5，12：i：-，無4，12：i：-血清型。采用PCR檢測52株單相變異株中fljB，fljA和hin基因的表達情況。通過統計發現，f l jB基因缺失株有44株，占84.6%。進一步檢測fljB基因未缺失的8株單相變異株的fljA和hin基因后發現有2株fljA和hin基因同時缺失，另外6株均檢測到f l jA和hin基因。

2.3 鼠傷寒沙門菌單相株對14種抗菌藥物的敏感性

鼠傷寒沙門菌單相株中有3株對14種抗菌藥物均敏感。有40株多重耐藥，其中有36株（69.23%）耐4類以上抗菌藥物，有13株（25%）耐6～7類抗菌藥物。見圖1。

圖1 52株鼠傷寒沙門菌單相株對常用抗菌藥物的耐藥譜分析

從2013—2015年上海市疾病預防控制中心保存的沙門菌中每年分別隨機抽取22株共66株鼠傷寒沙門菌雙相株（4，[5]，12：i：1，2）作為對照，采用上述方法檢測耐藥譜。將2013—2015年的單相株與雙相株的耐藥結果進行比較，發現在單相株和雙相株中分別有76.92%和48.48%的菌株耐3類以上抗菌藥物。耐藥譜中，雙相株和單相株對AMP、SF、S、TE、NAL和C均表現出較高的耐藥性，但單相株對氨芐西林-鏈霉素-磺胺類藥-四環素（ampicillin-streptomycin-sulfonamidetetracycline，ASSuT）或青霉素-氯霉素-鏈霉素-磺胺類藥-四環素（ampicillin-chloramphenicolstreptomycin-sulfonamide-tetracycline，ACSSuT）的耐藥率遠高于雙相株（P＜0.05）。見表2。

表2 2013—2015年鼠傷寒沙門菌單相株和雙相株耐藥率比較 （%）

3 討論

近十年來，國外文獻報道鼠傷寒沙門菌單相變異株在動物和人群中快速傳播，在引起感染的沙門菌血清型中比例大幅上升[7]，造成了多起食源性疾病的暴發[8]，同時，鼠傷寒沙門菌單相變異株也是引起醫院交叉感染的重要致病菌之一[9]。在我國，關于鼠傷寒沙門菌單相變異株的報道較少。為獲得上海市鼠傷寒沙門菌單相變異株的流行情況、表型及基因型和耐藥譜等基礎數據，本研究結合分子生物學技術和血清分型的方法，對2013—2015年上海市流行的沙門菌進行鑒定，結果顯示，鼠傷寒沙門菌單相變異株在所有血清型沙門菌和鼠傷寒沙門菌中的構成比分別為4.4%和23.3%。這些病例主要以青中年人群為主，且主要分布在郊區，提示這可能與中青年人群的飲食習慣差于青少年及老年人群，郊區人群的衛生意識等弱于市區人群有關。

目前，關于我國鼠傷寒沙門菌單相變異株的報道較少的原因比較復雜，可能與傳統血清分型方法受到誘導次數、誘導瓊脂、誘導血清等多種因素的影響有關。另外，檢測工作量大、工作時間長，對實驗人員技術要求高導致記錄不完整或命名混亂等也是原因之一。眾多因素導致部分單相變異株漏檢，影響到對該單相變異株的防控與治療。本研究檢出的52例鼠傷寒沙門菌單相變異株的血清型均為4，5，12：i：-，無4，12：i：-血清型。在鼠傷寒沙門菌中，有Ⅰ相和Ⅱ相鞭毛素編碼基因分別位于染色體不同的部位，常以fliC和fljB分別表示。最初認為鼠傷寒沙門菌單相變異株是由fljB基因的缺失引起，在采用血清型方法進行鑒定時，由于存在上述多種因素的影響，歐洲食品安全局建議采用PCR擴增鼠傷寒沙門菌特異性片段fliB-fliA基因間區并以缺失fljB基因為標準來判定鼠傷寒沙門菌單相變異株[10]。但之后的研究發現部分鼠傷寒沙門菌單相變異株不缺失fljB基因。本研究結合傳統的血清學鑒定方法和fliB-fliA基因間區PCR鑒定方法來檢測鼠傷寒沙門菌單相變異株，共鑒定出52株單相變異株。進一步通過對鞭毛抗原編碼基因的檢測分析，發現有44株（84.6%）為fljB基因缺失型，與文獻報道的部分鼠傷寒沙門菌單相變異株仍然含有完整的fljB基因結果相一致，提示在我國也存在fljB基因不缺失的鼠傷寒沙門單相株，因此不建議單純依賴fljB基因檢測來判定單相變異株。在Ⅱ相鞭毛素編碼基因fljB的下游緊鄰一個被稱為fljA的特殊基因，與fljB構成同一基因簇fljBA，在fljBA的上游，存在一個編碼重組酶的hin基因，影響f l jBA啟動區域方向的正確性，如“開關”一樣控制fljBA的表達[11]，fljA和hin等調控基因可能參與了鼠傷寒沙門菌單相突變的發生。本研究對8株fljB基因未缺失的單相變異株進行fljA和hin基因檢測，其中有2株同時缺失fljA和hin基因，還有6株菌fljA和hin基因均未缺失，提示可能存在其他更復雜的調控機制引起Ⅱ相鞭毛素編碼基因缺失[12]。

耐藥率升高和多重耐藥是鼠傷寒沙門菌單相變異株對人類健康的另一大威脅[13]。本研究結果顯示鼠傷寒沙門菌單相變異株有著較高的耐藥率，進一步的耐藥譜分析結果顯示上海地區的耐藥譜與發達國家的耐藥譜相似，以ASSuT四重耐藥為典型，遠高于鼠傷寒沙門菌雙相株（P＜0.05），該數據也與我國關于食物中分離的鼠傷寒沙門菌單相變異株耐藥特點相符[14]。本研究的結果同時顯示多重耐藥尤其是耐4類以上抗菌藥物的鼠傷寒沙門菌單相株比例在ASSuT耐藥的基礎上，又增加了臨床常見藥物NAL和C等，這提示上海地區對單相變異株的防控形勢更加嚴峻。這些多重耐藥單相變異株的出現帶來了較大的醫療負擔和健康危害，同時鼠傷寒沙門菌單相變異株作為寬宿主范圍血清型，可以廣泛感染動物和人，對公共衛生安全造成較大危害。針對這些問題，上海市各級衛生機構應加強對鼠傷寒沙門菌單相變異株的監測，了解其耐藥譜的變遷情況，為臨床醫生提供預防和治療感染的合理方案，這具有非常重要的臨床應用價值。

綜上所述，通過對2013—2015年上海市鼠傷寒沙門菌單相變異株的分析，本研究獲得了上海市鼠傷寒沙門菌單相變異株的流行背景信息、血清型和基因型特征，其地域分布及年齡分布結果提示在未來的疾病防控中應以郊區人群及青中年人群為重點防控對象。沙門菌監測人員要重視這類血清型，規范記錄。單相變異株部分基因的缺失及表達，給進一步的機制研究提供了重要數據，并有助于研制有針對性的疫苗和治療藥物。在臨床對抗菌藥物的使用中，4類以上藥物耐藥菌是重點監測對象，本研究為臨床用藥提供了重要的參考。在以后的工作中，應每年針對鼠傷寒沙門菌單相變異株進行類似研究，關注其流行趨勢，以有效防控。