經導管肝動脈化療栓塞術肝癌患者外周血淋巴細胞亞群與預后的相關性

孟志民， 朱 捷， 張春燕， 郭 瑋， 潘柏申， 王蓓麗

（復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是病死率最高的惡性腫瘤之一。我國每年約有38.3萬人死于肝癌及其并發癥，占全球肝癌死亡數的51%[1]。在全球范圍內，肝癌的發病率逐年攀升。據估計，到2025年，每年肝癌的發病數將超過100萬例[2]。手術切除是目前治療肝癌的唯一根治性手段。當腫瘤已發生轉移不宜進行手術時，常會選擇非手術手段對疾病進行干預，如經導管肝動脈化療栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）術。TACE術的治療原理是將導管插入腫瘤供血動脈后，使用栓塞劑將靶動脈封閉，從而使腫瘤組織缺血壞死，縮小腫瘤。但TACE術的預后卻因人而異，其原因之一是患者自身免疫狀況不同。機體的免疫情況與腫瘤的發生、發展有密切聯系，免疫細胞能直接參與腫瘤炎癥微環境的形成及腫瘤細胞的免疫監視、逃逸[3-4]。使用流式細胞術檢測外周血中淋巴細胞亞群的分布可以有效地反映人體免疫狀況。鑒于肝癌患者TACE術后尚無有效的標志物對預后進行有效的判斷，本研究擬分析肝癌患者外周血淋巴細胞亞群分類與TACE術預后之間的關系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年7月—2016年6月至復旦大學附屬中山醫院就診并行TACE術治療的肝癌初診患者214例，其中男183例、女31例，年齡38～67歲。肝癌依據國家衛生計生委2011年版《原發性肝癌診療規范》診斷，術前未接受過放療、化療等相關治療。入選標準：年齡≥18歲，明確診斷為HCC。排除標準：（1）有其他腫瘤病史；（2）合并有其他惡性腫瘤；（3）入院前經過外院治療。

患者預后情況判斷：患者經TACE術治療，6個月后行磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）檢查，由2位影像學醫師對患者的MRI資料進行雙盲審查。預后情況分為疾病進展（progressive disease，PD；靶病灶最大徑之和至少增加≥20%，出現新病灶）、疾病穩定[stable disease，SD；靶病灶最大徑之和縮小未達部分緩解（partial response，PR），或增大未達PD]、PR（靶病灶最大徑之和減少≥30%，至少維持4周）、完全緩解（complete response，CR；所有靶病灶消失，無新病灶出現，且腫瘤標志物正常，至少維持4周）。因本研究入組人群無CR者，故將PR和SD者歸為疾病穩定組（134例），PD歸為疾病進展組（80例）。

收集所有患者的一般臨床資料。疾病穩定組與疾病進展組之間一般臨床資料差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 疾病穩定組與疾病進展組一般臨床資料的比較 （例）

1.2 檢測方法

采集所有患者術前乙二胺四乙酸抗凝全血樣本。采用FACS Canto Ⅱ流式細胞儀（美國BD公司）及配套6色TBNK試劑盒檢測淋巴細胞亞群。取全血樣本50 μL與20 μL抗體[CD3-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/CD16-藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）/CD56-PE/CD45-多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質復合物-花青苷5.5（peridinin-chlorophyll-protein complex-cyanin 5.5，PerCP-Cy 5.5）/CD4-藻紅蛋白-花青苷7（phycoerythrin- cyanin 7，PE-Cy 7）/CD19-別藻藍蛋白（allophycocyanin，APC）/CD8-別藻藍蛋白-花青苷 7（allophycocyanin- cyanin 7，APC-Cy 7）]混勻孵育15 min，加入紅細胞裂解液450 μL，混勻孵育10 min，然后上機檢測。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0和Graph prism 5.0軟件進行統計分析。呈正態分布的數據以±s表示，組間比較采用配對t檢驗。采用Logistic回歸分析評估患者臨床信息與檢測指標之間的關系及肝癌患者TACE術預后的危險因素。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌患者TACE術前淋巴細胞亞群分析

疾病穩定組CD4+細胞百分比、CD4+CD8+細胞百分比和CD4+/CD8+比值均明顯低于疾病進展組（P＜0.05），而CD19+細胞百分比、CD3+細胞百分比、CD8+細胞百分比和CD56+細胞百分比差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 疾病進展組與疾病穩定組淋巴細胞亞群分類比較 （±s）

表2 疾病進展組與疾病穩定組淋巴細胞亞群分類比較 （±s）

組別 例數 CD19+細胞（%） CD3+細胞（%） CD4+細胞（%）疾病穩定組 134 15.52±7.80 65.24±10.87 39.69±7.01疾病進展組 80 14.96±6.39 67.51±9.37 42.97±8.18 P值 0.569 0.122 0.002組別 CD8+細胞（%） CD56+細胞（%） CD4+CD8+細胞（%） CD4+/CD8+比值疾病穩定組 22.79±7.67 16.55±7.81 2.31±1.45 1.99±0.96疾病進展組 21.13±6.52 14.40±7.52 3.10±2.29 2.29±1.08 P值 0.109 0.051 0.003 0.031

2.2 肝癌患者預后的二元Logistic回歸分析

根據第75百分位數將CD4+細胞百分比、CD4+CD8+細胞百分比及CD4+/CD8+比值各分為2組：＜46%組和≥46%組、＜3%組和≥3%組、＜2.5組和≥2.5組。單因素回歸分析顯示：性別、腫瘤數量、CD4+細胞百分比、CD4+CD8+細胞百分比與TACE術后肝癌患者的預后存在關聯[比值比（odds ratio，OR）值分別為0.432、1.978、2.896、1.293，95%可信區間（confidence interval，CI）分別為0.200～0.934、1.123～3.484、1.531～5.478、1.080～1.593]。多因素回歸分析顯示腫瘤數量、CD4+細胞百分比和CD4+CD8+細胞百分比是TACE術后肝癌患者預后的獨立危險因素（OR值分別為1.931、3.096、2.105，95%CI分別為1.058～3.526、1.584～6.052、1.079～4.108）。見表3。

2.3 不同CD4+CD8+及CD4+細胞百分比的患者在疾病穩定組和疾病進展組中的比例

表3 肝癌患者預后的二元Logistic回歸分析

疾病穩定組中CD4+細胞百分比≥46%者占17.16%，CD4+CD8+細胞百分比≥3%者占19.40%，均明顯低于疾病進展組（37.50%、33.75%）（P＜0.05）。見圖1、圖2。

3 討論

圖 1 不同CD4+CD8+細胞百分比患者在疾病穩定組和疾病進展組中的比例

圖 2 不同CD4+細胞百分比患者在疾病穩定組和疾病進展組中的比例

肝癌是世界范圍內高發的惡性腫瘤之一。使用手術方式將癌變組織及腫瘤切除是肝癌治療的首選方法，但有近40%的中晚期患者因為腫瘤過大或已發生播散轉移，不適合使用切除術[5]，轉而依據BCLC評分以及患者自身狀況，選擇TACE術或射頻消融術對腫瘤進行干預性治療。有部分患者在TACE術后腫瘤依然持續性進展，這與患者自身的免疫狀況有關。

T淋巴細胞亞群是人體免疫系統中最主要的抗腫瘤免疫方式[6]。T淋巴細胞可依據表面標志物的差異分為CD4+細胞及CD8+細胞，兩者在機體免疫中發揮著不同的作用。活化的CD4+細胞通過分泌多種細胞因子提升其他免疫細胞的免疫功能，如促進B細胞分泌抗體、刺激自然殺傷細胞分泌γ-干擾素（interferon gamma，IFN-γ）等，從而激活機體整體的免疫反應，CD4+細胞可以進一步分為輔助性T細胞（T helper cell，Th）1細胞、Th2細胞以及Th17細胞，它們可分泌不同的細胞因子介導炎癥反應，在抵御感染、腫瘤、自身免疫性疾病中發揮作用。CD8+細胞通過Fas-FsaL途徑、穿孔素、IFN-γ、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等直接殺傷靶細胞，是抗腫瘤免疫中最主要的免疫細胞。本研究結果顯示，疾病進展組CD4+細胞百分比及CD4+/CD8+比值均高于疾病穩定組（P＜0.05）。表明在腫瘤進展過程中，人體內存在明顯的免疫炎癥反應，隨著腫瘤負荷的增加，炎癥程度也進一步增強，機體處于免疫激活狀態。侯恩存等[7]比較了肝癌患者TACE術術前與術后淋巴細胞亞群的比例，結果顯示TACE術后，隨著腫瘤負荷的減輕，人體內淋巴細胞亞群的比例也逐漸恢復至較為正常的水平。

CD4+CD8+細胞是一類具有獨特免疫功能的T淋巴細胞[8]，可以在炎癥及腫瘤免疫中發揮作用。QUANDT等[9]認為這類細胞同時具有CD4+及CD8+細胞的特性，可以分泌白細胞介素（interleukin，IL）21、IL-4和IFN-γ等細胞因子，在機體免疫的過程中發揮著獨特的作用。DESFRANCOIS等[10-11]的研究結果顯示腫瘤浸潤的CD4+CD8+細胞可以分泌IL-13、IL-4和TNF-α，直接作用于腫瘤細胞，抑制其生長并將其殺死。WANG等[12]的研究結果顯示，肝癌患者的CD4+CD8+細胞會異常表達STAT3磷酸化蛋白，能促進IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10分泌，在炎癥及腫瘤的發生、發展中起重要作用。另外，其他類型的免疫細胞也與腫瘤有關。PAN等[13]的研究結果顯示，采用過繼免疫療法在患者體內輸注細胞因子誘導的殺傷（cytokineinduced killer，CIK）淋巴細胞可以有效抑制肝癌的進展，延緩或阻止腫瘤切除術后肝癌的復發。ZHENG等[14]的研究結果顯示，肝癌患者的CXCR3+效應T細胞及CD62L+T細胞在經TACE術治療后會明顯升高，提示其與腫瘤相關。不同亞類的T細胞在抗腫瘤方面具有不同的作用。CD4+CD8+細胞作為近幾年來新發現的一類細胞，其在腫瘤發生、發展過程中的具體機制尚不明確，值得進一步研究。

綜上所述， TACE術前CD4+CD8+細胞百分比是肝癌預后不良的獨立危險因素，可作為一種潛在的指標輔助臨床判斷肝癌患者TACE術的預后。本研究也存在一定的不足之處：（1）未進一步探討相關的免疫細胞通過何種途徑影響腫瘤的發生、發展；（2）僅僅分析了基本的淋巴細胞亞類，未進一步細分是何種類型的T淋巴細胞與肝癌的復發有關。因此，在后續的研究中，我們將進一步對已發現的結果展開分析，完善本研究得出的結論。