單核細(xì)胞HLA-DR和CD16檢測在炎癥性疾病中的應(yīng)用價(jià)值

章黎華，王維維，張 良，沈立松

（1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200092；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院泌尿外科，上海 200092）

炎癥反應(yīng)是臨床常見的疾病過程，感染、損傷、自身免疫性疾病等都會發(fā)生或伴有一定程度的炎癥反應(yīng)。單核細(xì)胞作為機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的主要成員之一，能夠吞噬入侵體內(nèi)的異物和病原微生物，釋放多種細(xì)胞因子，并參與抗原提呈、免疫調(diào)節(jié)等過程，在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用[1]。表達(dá)于單核細(xì)胞上的人白細(xì)胞抗原-DR（human leukocyte antigen-DR，HLA-DR）屬于主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ類分子，能將抗原提呈給輔助性T細(xì)胞，誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動[2]。CD16為IgG Fc段受體分子，屬于免疫球蛋白超家族成員。相對于CD16-單核細(xì)胞，CD16+單核細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等促炎因子的能力較強(qiáng)，與感染和炎癥性疾病的發(fā)病過程密切相關(guān)[3]。本研究擬分析炎癥性疾病患者單核細(xì)胞HLA-DR、CD16表達(dá)與其他白細(xì)胞指標(biāo)的相關(guān)性，以評估單核細(xì)胞HLA-DR和CD16診斷炎癥性疾病的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2017年3—7月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院診斷為炎癥性疾病的患者56例，其中男33例，女23例，年齡（60.05±13.56）歲，包括肺炎（肺部感染）36例、支氣管炎3例、胸膜炎3例、膿胸2例、膿毒血癥5例、泌尿道感染5例、急性胃腸炎1例，化膿性脊柱炎1例。另選取同期上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院體檢健康者40名作為正常對照組，其中男23名，女17名，年齡（58.92±11.36）歲，排除血常規(guī)、血糖、血脂、肝功能及腎功能異常者。2個組年齡和性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集炎癥性疾病患者疾病發(fā)作期空腹靜脈血2～3 mL，采集正常對照組體檢當(dāng)日空腹靜脈血2～3 mL，均采用肝素抗凝。

1.2.2 單核細(xì)胞HLA-DR和CD16檢測 將50 μL抗凝全血與抗人CD14抗體-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、抗人HLA-DR抗體-蓮紅蛋白（phycoerythrin，PE）（美國Beckman-Coulter公司）和抗人CD16抗體-多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物 花青苷5.5（peridinin-chlorophyllprotein complex cyanin5.5，PerCP Cy5.5）（美國BD公司）各5 μL充分混勻，避光共同孵育15 min。取出孵育完成的樣本，加入1 mL紅細(xì)胞裂解液[0.15 mol/L NH4Cl、10 mmol/L NaHCO3、1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid-Na2，EDTANa2）]，待紅細(xì)胞充分裂解后，在FACSCantoⅡ六色流式細(xì)胞儀（美國BD公司）上進(jìn)行檢測。采用相同的檢測電壓和熒光補(bǔ)償，通過CD14和側(cè)向散射（side scatter，SSC）對單核細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門，每份樣本獲取2 000個單核細(xì)胞，固定各陽性“門”位置，分別檢測單核細(xì)胞HLA-DR、CD16表達(dá)量[用平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）表示，即HLA-DR MFI、CD16 MFI]；同時檢測單核細(xì)胞中的HLADR陽性細(xì)胞百分比（HLA-DR+%）、HLA-DR陽性分子MFI（HLA-DR+MFI）、CD16陽性細(xì)胞百分比（CD16+%）和陽性分子MFI（CD16+MFI）。比較各組中CD16+與CD16－單核細(xì)胞HLA-DR MFI是否存在差異。

1.2.3 白細(xì)胞各項(xiàng)指標(biāo)的檢測 采用LH750血液分析儀（美國Beckman-Coulter公司）及配套試劑檢測中性粒細(xì)胞絕對數(shù)（neutrophil absolute value，NEUT#）、中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（neutrophil percentage，NEUT%）、淋巴細(xì)胞絕對數(shù)（lymphocyte absolute value，LYMPH#）、淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（lymphocyte percentage，LYMPH%）、單核細(xì)胞絕對數(shù)（monocyte absolute value，MO#）及單核細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（monocyte percentage，MO%），計(jì)算中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值（neutrophil/lymphocyte ratio，NLR）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估單核細(xì)胞HLA-DR MFI、HLA-DR+%、HLADR+MFI、CD16 MFI、CD16+%和CD16+MFI診斷炎癥性疾病的價(jià)值。采用Spearman相關(guān)分析評估單核細(xì)胞HLA-DR MFI、HLADR+%、HLA-DR+MFI、CD16 MFI、CD16+%和CD16+MFI與白細(xì)胞各項(xiàng)指標(biāo)[NEUT#、NEUT%、LYMPH#、LYMPH%、MO#、MO%及NLR]的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 炎癥性疾病組與正常對照組白細(xì)胞各項(xiàng)指標(biāo)的比較

炎癥性疾病組NEUT%、NEUT#、MO#及NLR均明顯高于正常對照組（P＜0.01），而LYMPH#和LYMPH%均明顯低于正常對照組（P＜0.01）。2個組之間MO%差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 炎癥性疾病組與正常對照組白細(xì)胞各項(xiàng)指標(biāo)的比較 （±s）

表1 炎癥性疾病組與正常對照組白細(xì)胞各項(xiàng)指標(biāo)的比較 （±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01

MO%（%）炎癥性疾病組 56 9.68 ± 4.27* 82.25 ± 7.08* 1.04 ± 0.50* 9.83 ± 4.63* 10.79 ± 6.12* 0.77 ± 0.33* 7.02 ± 3.44正常對照組 40 3.45 ± 0.88 58.09 ± 5.94 1.93 ± 0.38 33.23 ± 6.05 1.86 ± 0.64 0.36 ± 0.09 6.09 ± 1.27組別 例數(shù) NEUT#（×109/L）NEUT%（%）LYMPH#（×109/L）LYMPH%（%） NLR MO#（×109/L）

2.2 炎癥性疾病組與正常對照組單核細(xì)胞HLADR和CD16表達(dá)的比較

炎癥性疾病組單核細(xì)胞HLA-DR MFI、HLA-DR+%及HLA-DR+MFI均明顯低于正常對照組（P＜0.01），而單核細(xì)胞CD16 MFI、CD16+%及CD16+MFI均明顯高于正常對照組（P＜0.01）。見表2。

炎癥性疾病組中CD16+單核細(xì)胞的HLADR MFI為2 869±1 084，明顯高于CD16-單核細(xì)胞（1 121±665）（P＜0.01）。正常對照組中CD16+單核細(xì)胞的HLA-DR MFI為4 801±1 822，明顯高于CD16-單核細(xì)胞（3 696±1 239）（P＜0.01）。

表2 炎癥性疾病組與正常對照組單核細(xì)胞HLA-DR和CD16表達(dá)的比較 （±s）

表2 炎癥性疾病組與正常對照組單核細(xì)胞HLA-DR和CD16表達(dá)的比較 （±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01

組別 例數(shù) HLA-DR MFIHLA-DR+%（%） HLA-DR+ MFI CD16 MFI CD16+ %（%） CD16+ MFI炎癥性疾病組 56 1 426 ± 733* 71.44 ± 21.15* 1 823 ± 568* 467 ± 237* 18.14 ± 13.70* 3 272 ± 1 753*正常對照組 40 3 805 ± 1 266 98.69 ± 2.12 3 838 ± 1 250 155 ± 48 9.59 ± 4.74 871 ± 256

2.3 單核細(xì)胞HLA-DR MFI、HLA-DR+%、HLA-DR+ MFI、CD16 MFI、CD16+%和CD16+MFI與白細(xì)胞各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析

單核細(xì)胞HLA-DR+%、HLA-DR MFI、HLA-DR+MFI與LYMPH#、LYMPH%呈正相關(guān)（P＜0.01），與NEUT#、NEUT%、NLR、MO#呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與MO%無相關(guān)性（P＞0.05）；單核細(xì)胞CD16 MFI和CD16+MFI與NEUT#、NEUT%、NLR、MO#呈正相關(guān)（P＜0.01），與LYMPH#、LYMPH%呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與MO%無相關(guān)性（P＞0.05）。單核細(xì)胞CD16+%與NEUT#、NLR、MO#、MO%呈正相關(guān)（P＜0.05），與LYMPH#、LYMPH%呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與NEUT%無相關(guān)性（P＞0.05）。見表3。

表3 單核細(xì)胞HLA-DR、CD16與白細(xì)胞各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4 單核細(xì)胞HLA-DR MFI、HLA-DR+%、HLA-DR+ MFI、CD16 MFI、CD16+%和CD16+MFI診斷炎癥性疾病的價(jià)值

ROC曲線分析顯示，單核細(xì)胞HLA-DR MFI、HLA-DR+%、HLA-DR+MFI、CD16 MFI、CD16+%和CD16+MFI診斷炎癥性疾病的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.944、0.944、0.924、0.911、0.722、0.979。見表4、圖1、圖2。

表4 單核細(xì)胞HLA-DR、CD16診斷炎癥性疾病的價(jià)值

圖1 單核細(xì)胞HLA-DR MFI、HLA-DR+%和HLA-DR+MFI診斷炎癥性疾病的ROC曲線

圖2 單核細(xì)胞CD16 MFI、CD16+%、CD16+ MFI診斷炎癥性疾病的ROC曲線

3 討論

單核細(xì)胞來源于骨髓造血干細(xì)胞，在血液中停留幾天后遷移到不同的周圍組織中，分化為巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞[4]。因此，作為巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的前體細(xì)胞，單核細(xì)胞在功能上兼具這2類細(xì)胞的特點(diǎn)，在炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中參與免疫防御、抗原提呈等環(huán)節(jié)而發(fā)揮作用。

根據(jù)細(xì)胞表面CD14和CD16表達(dá)的差異，可將血液中的單核細(xì)胞分為3個亞群：典型（CD14+CD16-）、中間型（CD14++CD16+）和非典型（CD14+CD16++）[4]。對于中間型和非典型單核細(xì)胞中哪一亞群與炎癥因子的產(chǎn)生關(guān)系更密切，目前尚無定論[5]。本研究將單核細(xì)胞分為CD14+CD16-和CD14+CD16+2個亞群進(jìn)行分析。結(jié)果顯示炎癥性疾病患者發(fā)病時外周血中CD14+CD16+單核細(xì)胞的比例明顯增高。該群單核細(xì)胞在血管內(nèi)皮爬行時，能及時感應(yīng)到炎癥或損傷發(fā)生的信號并快速遷移至組織中，分泌TNF-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-8等多種細(xì)胞因子，從而增強(qiáng)局部的炎癥反應(yīng)[3，5]。而且CD14+CD16+單核細(xì)胞HLADR的表達(dá)強(qiáng)度比CD14+CD16-單核細(xì)胞更高，提示CD14+CD16+單核細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗原提呈能力。另外，炎癥性疾病患者單核細(xì)胞HLADR+%和HLA-DR MFI均顯著降低。抗原提呈細(xì)胞上HLA-DR的低水平表達(dá)說明炎癥性疾病發(fā)生時人體處于一定程度的免疫抑制狀態(tài)。HLA-DR作為MHCⅡ類分子，其表達(dá)可受內(nèi)毒素、TNF-α等刺激而下調(diào)[6]，故炎癥及感染狀態(tài)下單核細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)水平會下降。多項(xiàng)研究證實(shí)，危重患者中單核細(xì)胞HLA-DR的低表達(dá)與患者發(fā)生細(xì)菌感染、膿毒血癥密切相關(guān)[7-9]。

本研究結(jié)果顯示炎癥性疾病患者單核細(xì)胞絕對數(shù)明顯高于正常對照者，說明單核細(xì)胞在炎癥反應(yīng)過程中增殖并起重要作用。此外，單核細(xì)胞HLA-DR和CD16的表達(dá)與NEUT#、LYMPH#、LYMPH%、NLR等白細(xì)胞指標(biāo)有較強(qiáng)的相關(guān)性（P＜0.01），提示單核細(xì)胞HLADR、CD16很可能與中性粒細(xì)胞、NLR等常規(guī)指標(biāo)類似，可反映炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度。在炎癥性疾病發(fā)生時，單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)降低和CD16表達(dá)升高很可能與粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的變化同步發(fā)生，即這些細(xì)胞共同參與炎癥反應(yīng)過程中的免疫應(yīng)答。ROC曲線分析顯示，單核細(xì)胞HLA-DR MFI、HLA-DR+%、CD16 MFI和CD16+%對炎癥性疾病的診斷具有較高的價(jià)值。由于不同熒光抗體或流式檢測平臺之間存在一定的差異，因此建議各實(shí)驗(yàn)室自行建立參考區(qū)間。

近年來，學(xué)者們相繼開展了許多研究，發(fā)現(xiàn)了降鈣素原、高敏C反應(yīng)蛋白等生物標(biāo)志物可作為診斷感染性疾病的有效指標(biāo)[10-11]。感染是炎癥性疾病的常見誘因。由于研究對象的選擇有限，本研究結(jié)果主要反映了細(xì)菌感染型炎癥性疾病的情況。雖然細(xì)菌是引起感染性疾病的主要病原體，但在病毒、真菌等微生物感染引起的炎癥反應(yīng)中單核細(xì)胞HLADR、CD16的表達(dá)是否會出現(xiàn)相應(yīng)的變化，目前仍不甚明確。有研究指出CD14+CD16+單核細(xì)胞與乙型肝炎患者HBV病毒復(fù)制和疾病進(jìn)程間存在相關(guān)性[12]，但其對病情評估和預(yù)后判斷的價(jià)值還有待研究。此外，本研究調(diào)查對象以急性炎癥性疾病患者為主，且其中發(fā)生單一系統(tǒng)的局部炎癥反應(yīng)者居多，而單核細(xì)胞HLA-DR、CD16的表達(dá)水平在急性和慢性炎癥反應(yīng)、局部炎癥反應(yīng)和全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)中是否存在差異，還需進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。除了輔助診斷炎癥性疾病外，單核細(xì)胞CD16和HLA-DR在其他疾病中的意義也被逐步研究并報(bào)道。CD14+CD16+單核細(xì)胞不但在感染性炎癥反應(yīng)中明顯增殖，還與自身免疫性疾病、糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生有關(guān)聯(lián)[1，13-14]。單核細(xì)胞HLA-DR亦可作為創(chuàng)傷、手術(shù)、器官移植后機(jī)體免疫狀態(tài)和療效評價(jià)的指標(biāo)[15-18]。

綜上所述，單核細(xì)胞HLA-DR和CD16的表達(dá)變化與炎癥性疾病的發(fā)病過程具有較好的相關(guān)性，可用于炎癥性疾病的診斷，還可以輔助評估炎癥反應(yīng)程度并監(jiān)測機(jī)體的免疫狀態(tài)。