陰道黏膜修復敷料的生物學評價

李曉春 王莉芳 鄭 旭 徐長根

陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西西安 710065

自2014年6月1日起開始施行的《醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例》中明確提出國家對醫(yī)療器械按照風險程度實行分類管理。 根據(jù)2017年8月頒布的醫(yī)療器械分類目錄[1]，陰道黏膜修復敷料屬于無源植入器械中的組織工程支架材料，屬Ⅲ類器械，即屬具較高風險，需采取特別措施嚴格控制管理以保證其安全、有效的醫(yī)療器械[2]。我們按照GB/T系列標準對陰道黏膜修復敷料進行了細胞毒性、遲發(fā)型過敏及刺激等生物學評價，給出其應用于臨床的可行性分析，現(xiàn)報道如下。

1 試驗材料

1.1 供試品

三個廠家提供的供試品，分別記為1#、2#、3#，均為殼聚糖類修復敷料。

1.2 材料、藥品、試劑

高密度聚乙烯：批號：K0M357，美國藥典委員會；氯化鈉注射液，批號：160130 3G，西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司；優(yōu)級胎牛血清，貨號：TBD21HY，天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；RPMI培養(yǎng)基，批號：AB10125297，HyClone；青鏈霉素混合液（100×），批號：20170503，Solarbio；胰蛋白酶，批號：SLBP8607V，Sigma；二甲基亞砜（DMSO），批號：20140305，國藥集團化學試劑有限公司；噻唑藍（MTT），批號：MKBN7264V，Sigma。

1.3 細胞及動物

細胞株，L929細胞，武漢博士德生物工程有限公司。

白化豚鼠、雌性白化新西蘭兔，由西安市迪樂普生物資源開發(fā)有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（陜）2014-001。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～26℃，相對濕度40%～70%，實驗動物使用許可證號：SYXK（陜）2013-001。

1.4 儀器

電子天平，BS2202S，賽多利斯儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱，BSP-250，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；低速臺式離心機，KA-1000，上海安亭科學儀器廠；醫(yī)用凈化工作臺，SW-CJ-2F，蘇州安泰空氣技術有限公司；CO2培養(yǎng)箱，HF151，上海力康醫(yī)療設備有限公司；倒置相差顯微鏡，XSZ-D2，重慶光學儀器廠；酶標儀，Versa Max0310-3264，美國分子儀器有限公司。

2 方法

2.1 遲發(fā)型超敏反應封閉貼敷試驗[4-6]

健康白化豚鼠共35只，雌雄不限。30只作為試驗組，每個樣品10只，5只作為對照組。試驗前剔除豚鼠背部被毛。

（1）誘導階段

用吸收性紗布浸透供試品1mL，局部貼敷于每只動物的左上背部位。6h后除去包扎帶和紗布。1周中連續(xù)3d重復該步驟，同法操作3周。對照組以氯化鈉注射液同法操作。

（2）激發(fā)階段

最后一次誘導貼敷后14d，用供試品和氯化鈉注射液對全部動物進行激發(fā)。方法同（1），貼敷于每只動物去毛的未試部位。6h后除去包扎帶和紗布。

（3）動物觀察

激發(fā)后24h剃去激發(fā)部位及其周圍的被毛，溫水洗凈擦干，按表1對試驗部位評分，并于48h再次評分。

表1 Magnusson和Kligman分級

2.2 體外細胞毒性試驗（MTT法）[3，7-9]

（1）試驗樣品及試液的制備

供試液：無菌條件下將陰道黏膜修復敷料與含血清培養(yǎng)基按0.2g/mL的比例于37℃浸提24h后2000rpm離心5min，取上清。

陰性對照液：取高密度聚乙烯（厚度為1mm）36cm2，剪成5mm×25mm的小塊，加12mL細胞生長培養(yǎng)液，37℃浸提24h，過濾除菌。

陽性對照液：5%的DMSO溶液，過濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配。

空白對照液：同細胞生長培養(yǎng)液。

（2）方法：將細胞制成密度為1×104個/mL的細胞懸液并接種于96孔板，設空白對照、陰性對照、陽性對照和供試品組，每組各設至少6孔，每孔接種100μL。置CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)液。各組加入每孔100μL的相應溶液，繼續(xù)培養(yǎng)72h后顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，每孔加入20μL質量濃度為5g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去孔內液體，加入150μL的DMSO，酶標儀570nm和630nm波長下測定吸光度，按下式計算相對增值率（RGR）[10]。

RGR=A/A0×100%，式中：

RGR——相對增值率，%；

A——供試品組（陽性及陰性對照組）吸光度；

A0——空白對照組吸光度。

根據(jù)RGR按表2分級標準判定。陰性對照組的反應應不大于1級，陽性對照組至少為3級反應。

表2 細胞毒性反應分級

2.3 黏膜刺激試驗[4，11-12]

選取陰道無明顯刺激癥狀、無缺陷和無損傷的健康雌性家兔12只，體重不低于2kg，供試品組及對照組各3只。供試品組家兔陰道注入1mL供試品，對照組注入等量的氯化鈉注射液。每次間隔24h連續(xù)重復上述步驟，至少連續(xù)5d。末次接觸后24h，無痛處死動物，完整切下陰道后縱向切開，檢查黏膜組織的刺激、損傷及壞死情況。常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，LEICA生物顯微鏡觀察。按表3規(guī)定的記分系統(tǒng)進行評分。試驗組動物顯微鏡評價記分相加后再除以觀察總數(shù)即得試驗組平均記分，對照組同法計算。試驗組平均記分減去對照組平均記分即得出刺激指數(shù)，見表4。

3 結果

3.1 遲發(fā)型超敏反應試驗結果

供試品組及對照組中豚鼠的反應等級均為0，在本試驗條件下，均未觀察到三批陰道黏膜修復敷料導致豚鼠出現(xiàn)遲發(fā)型超敏反應跡象，結果見表5。

3.2 體外細胞毒性試驗結果

結果表明，陽性對照組細胞毒性反應級別為3級，陰性對照組細胞毒性反應級別為0級，試驗系統(tǒng)成立。三批陰道黏膜修復敷料的細胞毒性反應級別均不大于2級，在標準可接受范圍內[8]。顯微鏡下各組細胞形態(tài)見圖1，結果見表6。

表3 口腔、陰莖、直腸和陰道組織反應顯微鏡計分系統(tǒng)

表4 刺激指數(shù)

表5 遲發(fā)型超敏反應試驗結果

表6 細胞毒性試驗結果

圖1 顯微鏡下各組細胞形態(tài)

3.3 黏膜刺激性試驗結果

病理檢查結果顯示：對照組的黏膜層上皮結構完整，固有層可見極少量炎細胞浸潤，少數(shù)血管充血及極輕度水腫。試驗組的黏膜層上皮結構完整，固有層可見極少量炎細胞浸潤，輕度血管充血及極輕度水腫。結果表明，三批陰道黏膜修復敷料均具極輕度黏膜刺激，病理切片見圖2，計分結果見表7。

表7 陰道黏膜刺激性試驗結果

圖2 各組病理切片圖

4 討論

陰道黏膜修復敷料的主要成分為殼聚糖，是一種天然的堿性高分子化合物，具有良好的生物相容性、可降解性、吸附性、成膜性[13]，能激活陰道內多種免疫細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞的活性[14]，使機體的免疫系統(tǒng)得到恢復和加強，并能通過免疫調節(jié)作用發(fā)揮多種生理活性，誘導并提高細胞生長因子活性，改善陰道內的生態(tài)環(huán)境。具優(yōu)良的抑菌作用，對許多微生物包括細菌和真菌，都有不同程度的抑制作用。同時陰道黏膜修復敷料還有促進陰道內表皮細胞血液凝固的作用，可用作止血劑，保持創(chuàng)面濕潤，促進創(chuàng)面愈合[15]，對陰道黏膜的創(chuàng)口、感染、出血等癥狀產生積極的作用。目前，不少生物技術公司自主研發(fā)的陰道黏膜修復敷料進入了上市前評價階段，但由于生產工藝的改進過程中涉及到生物材料的修飾改性工藝，故急需對其應用于人體的生物安全性進行評價[16]。本文按照GB/T16886及GB/T14233的系列標準，對三批陰道黏膜修復敷料進行了生物安全性評價，結果顯示無豚鼠皮膚致敏反應，對家兔陰道黏膜具極輕度刺激，細胞毒性不大于2級，均在標準規(guī)定的可接受范圍內。初步認為三批陰道黏膜修復敷料毒性較低，有望用于臨床。