芪參二蓮湯對肝纖維化大鼠基質金屬蛋白酶—1及抑制因子的影響

艾迎春 遲男男 杜景峰 張雪梅

摘 要：目的 研究不同劑量芪參二蓮湯對肝纖維化大鼠基質金屬蛋白酶-1及抑制因子變化的影響。方法 于2017年6月～8月選擇90只SD雄性大鼠作為研究對象，按照體質量隨機分為6組，每組15只，其中1組為正常組，其余5組均為肝纖維化模型，將其分為模型組、秋水仙堿組以及芪參二蓮湯低劑量組（5 g/kg）、中劑量組（10 g/kg）和高劑量組（15 g/kg）；各給藥組分別給予相應的藥物灌胃，正常組、模型組則給予生理鹽水灌胃；對比各組大鼠MMP-1和TIMP-1水平以及肝纖維化指標水平。結果 正常組與模型組比較，后者的MMP-1、MMP-1/TIMP-1水平明顯降低，而TLISA-1水平則明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）；模型組與各給藥組比較，各給藥組的MMP-1、MMP-1/TIMP-1水平較模型組升高，而TIMP-1水平則較模型組降低，差異有統計學意義（P<0.05），且給藥組中，以芪參二蓮湯高劑量組的變化水平最為顯著，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 15 g/kg高劑量的芪參二蓮湯用于治療肝纖維化大鼠，能夠有效促進MMP-1表達、減少TIMP-1表達，進而起到逆轉肝纖維化的作用。

關鍵詞：芪參二蓮湯；肝纖維化；基質金屬蛋白酶-1；抑制因子

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.15.045

文章編號：1006-1959（2018）15-0140-03

Effects of Qishenerlian Decoction on Matrix Metalloproteinase-1 and Its Inhibitory Factors in Rats with Hepatic Fibrosis

AI Ying-chun，CHI Nan-nan，DU Jing-feng，ZHANG Xue-mei

（Department of Digestion，Subject Two，the First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，Heilongjiang，China）

Abstract：Objective To study the effects of different doses of Qishenerlian Decoction on matrix metalloproteinase-1 and inhibitor of hepatic fibrosis in rats.Methods In June to August 2017， 90 male SD rats were selected as the research subjects.According to the body mass，they were randomly divided into 6 groups，with 15 rats in each group，of which 1 was the normal group and the other 5 groups were liver fibrosis models.They were divided into model group，colchicine group and low dose group of Qishenerlian Decoction （5g/kg），medium dose group（10g/kg）and high dose group（15g/kg）.Each drug-administered group was given the corresponding drugs，and the normal group and the model group were given normal saline.The levels of MMP-1 and TIMP-1 and liver fibrosis were compared between the groups.Results Compared with the normal group，the level of MMP-1 and MMP-1/TIMP-1 in the model group was significantly decreased，while the level of TLISA-1 was significantly higher，the difference was statistically significant（P<0.05）；Compared with the drug-administered group，the MMP-1 and MMP-1/TIMP-1 levels in the model group were higher than those in the model group，while the TIMP-1 level was lower than that in the model group，the difference was statistically significant（P<0.05），and in the drug-administered group，the change level of the high-dose group of Qishenerlian Decoction was the most significant，and the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion The high dose Qishenerlian Decoction for 15g/kg can effectively promote the expression of MMP-1，reduce the expression of TIMP-1 and reverse the hepatic fibrosis in rats.

Key words：Qishenerlian Decoction；Hepatic fibrosis；Matrix metalloproteinase-1；Inhibitory factors

肝纖維化是體內有害因素的長期刺激使得肝臟內彌漫性細胞外基質（ECM）合成與降解不平衡而導致的一種病理變化。而基質金屬蛋白酶類（MMPs）與金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）則與ECM合成與降解具有具有密切關系。研究證實，通過調節MMPs/TIMPs的平衡，能夠有效抑制ECM的合成并促進其降解，故而成為逆轉肝纖維化的主要手段[1]。有研究顯示，芪參二蓮湯具有抗炎、保肝等作用，有助于調節MMPs/TIMPs平衡，進而達到逆轉肝纖維化的效果[2]。為進一步探究芪參二蓮湯對肝纖維化大鼠基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）及抑制因子（TIMP-1）的影響，本次研究選取了90只大鼠進行了實驗探究，現將具體內容報道如下。

1 材料與方法

1.1動物 于2017年6月～8月，在黑龍江中醫藥大學實驗動物中心選取90只SD雄性大鼠（動物合格證號[黑動字第]P00102005）作為研究對象，月齡2個月，體質量180～200 g，平均體質量（192.32±21.01）g；飼養于18～25 ℃室溫、50%～60%相對濕度的環境中。

1.2藥物與試劑 藥物：芪參二蓮湯：黃芪、虎杖、半邊蓮、茵陳蒿、半枝蓮、西洋參、石見穿、貓爪草各10 g，女貞子、五味子、墨旱蓮、甘草各15 g組成藥方，由煎藥室制備并濃縮；硫代乙酰胺（TAA）由上海麥克林生化科技有限公司提供，產品批號MFCD00008070；秋水仙堿片（云南植物藥業有限公司，國藥準字H53020166，0.5 mg/片）使用前將其研磨成細粉過100目篩，并用蒸餾水配比成混懸液。試劑：大鼠MMP-1和TIMP-1試劑盒（ELISA）。

1.3分組、造模和給藥 在對大鼠進行適應性飼養7d后，按照體質量進行隨機分組，總共分為6組，每組15只，分別為正常組、模型組、秋水仙堿組、芪參二蓮湯低劑量組（5 g/kg）、中劑量組（10 g/kg）和高劑量組（15 g/kg）；其中正常組大鼠行常規飼養，其余各組則采用硫代乙酰胺（TAA）灌胃法造肝纖維化模型，每2 d 1次，共持續7周。而后進行對照觀察，給藥組灌胃給藥劑量為：秋水仙堿0.105 g/kg，低劑量芪參二蓮湯5 g/kg，中等劑量芪參二蓮湯10 g/kg，高劑量芪參二蓮湯15 g/kg，而正常組與模型組則分別給予等量生理鹽水對大鼠進行灌胃；給藥體積均為8ml/kg，1次/d，連續給藥35 d。

1.4標本制備 于給藥35 d后，采用3%的戊巴比妥鈉1 ml/100 g對所有大鼠進行腹腔注射麻醉，而后行靜脈取血，靜置后采用5000 r/min的離心機進行離心分離7 min，取血清并置于-20 ℃的冰箱中保存備用；同時與大鼠肝左葉距邊緣約5 mm處取2塊規格為10 mm×10 mm×5 mm的組織塊。

1.5指標檢測 MMP-1和TIMP-1檢測：運用ELISA試劑盒與酶標儀對大鼠血清中的MMP-1和TIMP-1含量進行檢測；運用96孔板，分別設置標準孔、空白孔、模型孔、秋水仙堿孔以及芪參二蓮湯各劑量孔，在加入標準品50 μl以預計濃度梯度，將10 μl的待測樣本分別加入相對應的孔中，并加入40 μl的樣本稀釋液進行稀釋，在進行3次的洗板后加入酶標工作液，并按順序在每個孔中加入A液50 μl顯色劑，后加入B液50 μl顯色劑，將其置于37℃的恒溫箱內顯色15 min，最后用酶標儀進行檢測。

1.6統計學方法 采用SPSS 20.0進行數據分析，計量資料采用（x±s）表示，組間比較行t檢驗，計數資料則以[n（%）]表示，行？字2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1實驗大體情況 正常組與芪參二蓮湯高劑量組的大鼠飲食與體態正常，營養狀況較好，同時反應較為靈敏、眼神有關、皮毛有光澤且相對密集；而其余各組的大鼠飲食較少，皮毛黯淡無光并伴有不同程度的脫毛，體形消瘦且反應遲鈍。在實驗的過程有部分大鼠死亡，其中模型組死亡3只、秋水仙堿與芪參二蓮湯各劑量組各死亡1只，可能與灌胃損傷導致或藥物耐受差導致。

2.2芪參二蓮湯對肝纖維化大鼠MMP-1和TIMP-1水平的影響 正常組與模型組比較，后者的MMP-1、MMP-1/TIMP-1水平明顯降低，而TLISA-1水平則明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）；模型組與各給藥組比較，各給藥組的MMP-1、MMP-1/TIMP-1水平較模型組升高，而TIMP-1水平則較模型組降低，差異有統計學意義（P<0.05），且給藥組中，以芪參二蓮湯高劑量組的變化水平最為顯著，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

3 討論

肝纖維化是否能夠得到逆轉，主要取決于ECM的合成與降解是否能夠恢復平衡。因為ECM降解調控的主要手段是促進MMPs表達、降低TIMPs的表達，而MMP-1和TIMP-1的平衡發生變化則被認為是肝纖維化的主要原因[3]。因此，要實現肝纖維化的逆轉，恢復ECM的合成與降解平衡，需要從調節MMP-1和TIMP-1的表達入手。

祖國醫學認為，肝纖維化屬于“積聚”范疇，病機多為氣虛血瘀、絡氣不足、外感濕熱、凝聚成痰，從而引起病癥，故而主要為本虛標實、虛實夾雜。而芪參二蓮湯則以益氣扶正為主功效，同時還具有解毒化痰逐瘀等功效。方中的黃芪，為補藥之長，具有祛瘀散結之功；西洋參、五味子、女貞子等則有滋補肝腎、通絡活血等效果；而半邊蓮、半枝蓮等則清利濕熱；貓爪草、石見穿則化痰散結、解毒化瘀；甘草、虎杖等則能夠散瘀退黃、清血分肝絡之毒。故而全方共奏扶正祛邪、化痰逐瘀、活血解毒等功效。本次研究顯示，當運用劑量為15 g/kg時，對肝纖維化能夠起到良好的治療效果。

在本次研究中，通過將90只大鼠進行分組研究發現，正常組與模型組比較，正常組大鼠血清中MMP-1表達降低、TIMP-1表達升高，MMP-1/ TIMP-1比值降低（P<0.05）；該結果提示，肝纖維化與MMP-1、TIMP-1水平有關，當TIMP-1明顯升高抑制MMP-1表達時，大鼠會出現肝纖維化。而通過模型組與各給藥組比較，秋水仙堿組、芪參二蓮湯各劑量組大鼠血清中的MMP-1表達明顯提升、TIMP-1表達則顯著下降，MMP-1/ TIMP-1比值上升（P<0.05），但芪參二蓮湯高劑量組相對于其余各給藥組，MMP-1表達上升、TIMP-1表達下降以及MMP-1/ TIMP-1比值上升更為明顯（P<0.05）。該結果表示，運用高劑量芪參二蓮湯治療肝纖維化的大鼠，能夠有效促進MMP-1的表達，減少TIMP-1的表達。而MMP-1和TIMP-1作為影響與調節ECM的合成與降解平衡主要因素，MMP-1表達增加， TIMP-1表達減少時，能夠促進ECM合成與降解平衡的恢復，進而起到逆轉肝纖維化的作用。

綜上所述，15 g/kg高劑量的芪參二蓮湯用于治療肝纖維化大鼠，能夠有效促進MMP-1表達、減少TIMP-1表達，進而起到逆轉肝纖維化的作用。

參考文獻：

[1]袁星星，郭蕾，王炳予，等.芪參二蓮湯對肝纖維化大鼠血清基質金屬蛋白酶-1及其抑制劑-1水平的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2017，24（05）：52-56.

[2]山丹，巴圖德力根.肝纖維化與MMPs及TIMPs的研究進展[J].中國民族民間醫藥，2015，24（05）：39-40.

[3]王振常，楊刪，黃晶晶，等.柔肝化纖顆粒對CCl_4誘導的肝纖維化大鼠肝臟MMP-2、TIMP-2的影響[J].疑難病雜志，2014，13（01）：74-76，82.

收稿日期：2018-1-12；修回日期：2018-1-22

編輯/成森