神經生長因子受體p75NTR在喉癌Hep2細胞系中的表達

申宇鵬 李曉明 靳海峰 路秀英

摘 要：目的 初步探索神經生長因子受體在喉癌Hep2細胞系的表達情況并研究相關的細胞生物學特性。方法 應用免疫細胞化學及免疫熒光染色法，檢測p75NTR在喉癌Hep2細胞系中的表達；應用流式細胞儀檢測人喉癌Hep2細胞系中呈p75NTR高表達及CD133高表達細胞的分布比例情況。結果 喉癌Hep2細胞系內小部分腫瘤細胞顯示免疫染色強陽性，p75NTR強陽性顯色的細胞部分處于旺盛的增殖分裂狀態；大部分呈CD133強陽性的Hep2細胞也呈p75NTR強陽性。結論 p75NTR高表達于喉癌Hep2細胞系中具有較強增殖活力的細胞，p75NTR信號通路對支持或促進喉癌細胞增殖具有潛在作用。p75NTR高表達的喉癌Hep2細胞與腫瘤干細胞之間的關系密切，有待進一步深入研究。

關鍵詞：神經生長因子受體；喉癌；Hep2細胞系；免疫細胞化學

中圖分類號：R739.65 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.15.016

文章編號：1006-1959（2018）15-0047-05

Expression of Nerve Growth Factor Receptor p75NTR in Hep2 Cell Line of Laryngeal Squamous Cell Carcinoma

SHEN Yu-peng1，LI Xiao-ming1，JIN Hai-feng2，LU Xiu-ying1

（Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery1，Department of Digestive Medicine2，Bethune International Peace Hospital，Shijiazhuang 050081，Hebei，China）

Abstract：Objective To investigate the expression of nerve growth factor receptor in laryngeal squamous cell carcinoma Hep2 cell line and to study the related cellular biological characteristics.Methods Immunocytochemistry and immunofluorescence staining were used to detect the expression of p75NTR in Hep2 cell line of laryngeal squamous cell carcinoma，and the distribution of p75NTR and CD133 in Hep2 cell line of laryngeal squamous cell carcinoma was detected by flow cytometry.Results A small number of tumor cells in the Hep2 cell line of laryngeal squamous cell carcinoma showed strong immunostaining，and the cells with strong positive coloration of p75NTR were in a proliferative and dividing state；most of the Hep2 cells positive for CD133 were also strongly positive for p75NTR.Conclusion p75NTR is highly expressed in the Hep2 cell line of laryngeal squamous cell carcinoma and has strong proliferative activity.The p75NTR signaling pathway has a potential role in supporting or promoting the proliferation of laryngeal squamous cell carcinoma cells.The relationship between p75NTR-expressing laryngeal squamous cell carcinoma Hep2 cells and tumor stem cells is closely related and needs further study.

Key words：Nerve growth factor receptor；Laryngeal squamous cell carcinoma；Cell line Hep2；Immunocytochemistry

喉癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是頭頸外科臨床常見惡性腫瘤，喉癌通常可以損害患者的發音、呼吸、吞咽等功能，同時又具有破壞力強、易復發、易轉移等特點，臨床上很多患者難以治愈甚至危及生命。研究喉癌發病及惡性進展的相關機制，有助于探索治愈喉癌的有效途徑。近年來腫瘤干細胞理論逐漸成熟，眾多學者認為腫瘤組織內部包含少量擁有自我更新能力、分化能力及放化療抵抗能力的特殊細胞群，與腫瘤的治療后復發密切相關[1]。神經生長因子受體p75NTR（p75 neurotrophin receptor，p75NTR）是腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族成員之一，廣泛分布于人體各組織系統及腫瘤細胞中[2]。除中樞及外周神經系統外，p75NTR蛋白也廣泛地表達于上皮、間葉及淋巴造血組織等非神經組織系統。研究證實p75NTR在不同組織細胞類型、不同病理生理環境中執行的功能具有多樣性，能夠調節細胞的存活、增殖、分化、凋亡及創傷修復等效應[3]。近年來p75NTR在腫瘤細胞中的存在及作用引起廣泛關注，目前國內外關于p75NTR在喉癌細胞系中的表達及功能文獻少有報道，我們采用免疫細胞化學及流式細胞儀等方法研究p75NTR在喉癌Hep2細胞系中的表達規律和潛在作用，為進一步研究喉癌的綜合治療提供理論依據。

1材料與方法

1.1 Hep2細胞 人喉癌Hep2細胞系來自美國國家癌癥研究所病理實驗室，由白求恩國際和平醫院耳鼻咽喉科實驗室傳代培養。凍存Hep2細胞于37 ℃快速解凍，1000 rpm離心 5 min，用RPMI 1640培養基清洗1次，重懸后再離心，使用全培養基，設置為37 ℃培養于5%CO2的濕度培養箱中。

1.2主要抗體及試劑盒 免疫細胞化學試劑盒（SP-9002）系北京中杉金橋生物技術公司產品；磁珠分選試劑盒購自德國美天旎公司，p75NTR兔抗人單克隆抗體（ab52987）購自Abcam公司；CD133（18470-1-AP，proteintech）；HRP-山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術公司）；CY3標記兔二抗（protech）；Hoechst（碧云天）。

1.3儀器設備 熒光顯微鏡（DMIRB，德國Leica）；TGL-16G高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；流式細胞儀（美國Becton Dickinson FAC公司）；Hera CO2培養箱（德國GMBH公司）。

1.4免疫細胞化學及免疫熒光染色 將清潔消毒的20 mm蓋玻片置于六孔板培養皿中，以5×104/ml的密度在六孔板中接種細胞并爬片，48 h后行免疫細胞化學及免疫熒光染色。貼壁均勻的Hep2細胞爬片經4%多聚甲醛PB固定10 min，0.2%Triton X-100（含0.1%BSA）孵育10 min。免疫化學染色采用常規SP法。鋪片經3%過氧化氫溶液去除內源性過氧化物酶活性；滴加封閉用山羊血清，室溫孵育20min，消除非特異性顯色后，滴加一抗（p75NTR單克隆抗體稀釋度1∶50），4 ℃孵育過夜；陰性對照組采用PBS抗體稀釋液代替一抗；生物素標記二抗及辣根酶標記鏈霉素卵白素分別孵育20 min；使用新鮮配制的DAB顯色2 min，蘇木精復染，常規脫水、透明及中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

將前面制備的96孔板中的陽性細胞和陰性細胞分別進行p75NTR和CD133免疫熒光檢測。細胞經4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次；采用5%胎牛血清室溫下封閉1 h；添加一抗（P75NTR：1∶400；CD133：1∶100）4 ℃孵育過夜；PBS洗清洗后加二抗，37 ℃孵育1 h；室溫避光孵育Hoechst 15 min，熒光顯微鏡下拍照。

1.5喉癌Hep2細胞行p75NTR/CD133流式細胞儀檢測

1.5.1常規培養條件下Hep2細胞p75NTR陽性率檢測 喉癌Hep2細胞系培養在含有5%小牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基中，傳代次數<30次。制備活性高的細胞懸液，用含5%FCS的RPMI1640培養基調整細胞濃度為1×107/ml，取200 μl細胞懸液（數量約2×106細胞）加入含2%BSA的PBS，4 ℃封閉30 min，用洗滌液洗滌1次，加洗滌液2 ml左右1000 rpm×5 min棄上清。抗體終濃度標準為：p75NTR（FITC）1 μg/L×106細胞（1∶10），陰性對照采用小鼠IgG1同型對照（FITC）1∶10。混合充分后4 ℃ 30 min；用洗滌液洗滌2次，立即上流式細胞儀檢測。

1.5.2常規培養的Hep2細胞行p75NTR/CD133雙標記檢測 檢測步驟與前類似，同時加入p75NTR（FITC 1∶10）及CD133（PE 1∶11）兩種熒光直標抗體，共同避光孵育4 ℃ 30 min，洗滌2次后上流式細胞儀檢測，參考同型對照來調節電壓補償。檢測p75NTR/CD133雙陽性細胞占總體細胞數的百分比。

2結果

2.1 p75NTR在喉癌Hep2細胞系中的表達情況 我們采用p75NTR單克隆抗體對喉癌Hep2細胞系行免疫細胞化學染色及免疫熒光染色發現相同結果：一小部分Hep2細胞呈p75NTR免疫反應強陽性（計數約4%～6%），見圖1，免疫著色主要位于胞漿及胞膜。鏡下可見部分p75NTR強陽性細胞正處于細胞分裂狀態，也觀察到正處在DNA合成期、細胞分裂期及分裂后期的細胞也呈p75NTR強陽性染色。鏡下計數約30%～40%的細胞呈p75NTR免疫反應弱陽性，該部分細胞很少處于分裂期。此外，我們觀察到也有一些鏡下形態規則、外觀為圓形及梭型的細胞呈p75NTR強陽性，這些細胞生長狀態良好，并非凋亡的無結構殘體，我們推測這部分細胞可能與腫瘤干細胞群比較接近。將Hep2細胞行p75NTR免疫熒光染色（CY3），采用Hoechst做核標記，也觀察到上述類似結果。通過免疫細胞化學及免疫熒光染色我們確定p75NTR蛋白表達和喉癌Hep2細胞分裂增殖密切相關。

2.2喉癌Hep2細胞行p75NTR/CD133流式細胞儀檢測 為進一步分析喉癌Hep2細胞系中p75NTR強陽性表達細胞的特點，我們進行了流式細胞儀檢測。發現正常培養條件下，使用鼠IgG1同型對照FITC抗體，人喉癌Hep2細胞系中呈p75NTR強陽性的細胞比例為3.7%～6.2%左右。使用CD133抗體與p75NTR做雙標記檢測，雙向十字門流式散點圖可見，CD133強陽性細胞比率約0.7%，p75NTR及CD133雙標陽性細胞比率僅為0.5%。其中大部分CD133強陽性細胞也呈p75NTR強陽性。見圖2，圖3。

3討論

近年來針對頭頸部鱗狀細胞癌臨床治療中的易轉移、易復發、放化療耐受等特性和內在作用機制成為頭頸腫瘤科學研究的熱點。腫瘤組織在機體內的發病及生長都處在體液內環境中，受到人體微環境中眾多生長因子及相關受體通路的調節及支持。神經生長因子（nerve growth factor，NGF）是神經營養因子家族重要成員，在神經系統細胞的發育和再生過程中有重要作用[4]，NGF擁有低親和力的p75受體（p75NTR）和高親和力酪氨酸激酶受體（Trks），NGF與受體p75NTR和TrkA之間相互作用非常緊密，調控機理很復雜。p75NTR屬于細胞Ⅰ型跨膜糖蛋白，含有三個結構域：富含半胱氨酸的膜外區、一次性跨膜區、連接下游信號途徑的胞內區，共399個氨基酸組成。胚胎發育的早期，三個胚層的細胞均有p75NTR表達，發育成熟后部分組織內的表達下降或消失，在神經系統、上皮系統組織細胞內，發育成熟后仍有p75NTR表達。現有文獻支持，NGF及其受體在上皮來源惡性腫瘤的生長過程中有重要作用[5]。以往關于p75NTR的研究大多針對神經系統，在腫瘤細胞中的報道很少。我們前期通過免疫組織化學形態學研究已經證實，p75NTR在喉癌組織內存在陽性染色，目前p75NTR在喉癌細胞系中表達情況尚缺乏研究證實。

近年來有關p75NTR受體在腫瘤生長、進展、轉移中的作用引起國內外學者關注。越來越多的研究表明p75NTR在腫瘤的發生、轉移、治療耐藥中發揮了重要的作用，現有文獻證實，不同組織類型腫瘤中p75NTR執行的功能具有多樣性。Jin HF在胃癌的研究中證實p75NTR表達明顯降低或缺失，其表達水平與胃癌的分化程度負相關，穩定轉染p75NTR表達質粒可以明顯抑制胃癌細胞的增殖[5]。在膀胱癌及前列腺癌中p75NTR存在類似的抑癌作用[6]，學者們推測p75NTR抑制腫瘤的調節機制可能與其誘導凋亡的信號通路激活有關。與之相反，p75NTR在上皮細胞、食道、舌、口腔黏膜上皮等細胞中擁有明確的促增殖效應，這種效應也存在于這些組織起源的腫瘤細胞中。文獻報道神經營養因子通過其受體p75NTR及Trk刺激黑色素瘤細胞增殖和轉移，轉染p75NTRsiRNA能抑制黑色素瘤細胞遷移[7]。有文獻報道，食道鱗癌細胞系中p75NTR表達對細胞的存活和增殖具有支持作用，另有研究證實p75NTR結合其功能性配體NGF后，能通過激活NF-κB通路抑制乳腺癌細胞凋亡[8]。Soland經過口腔鱗癌的形態學研究發現，p75NTR表達和分布區域特性的改變能夠判斷患者治療后復發或預后不良[9]。至今p75NTR在頭頸腫瘤細胞中的調控機制尚未明確，與頭頸腫瘤組織細胞類型、分化程度、局部微環境等相關。

我們前期形態學研究發現，在喉鱗癌組織中TrkA及p75NTR的陽性染色呈現特征性分布[10]，p75NTR表達多位于粘膜基底層及腫瘤生發層，位于增殖活力旺盛的區域。通過免疫細胞化學及免疫熒光染色的方法，我們證實：人喉癌Hep-2細胞系中小部分Hep2細胞呈p75NTR強陽性。我們也觀察到，許多處在DNA合成期、細胞分裂期及分裂后期的Hep2細胞呈p75NTR免疫染色強陽性，這提示我們p75NTR表達與腫瘤細胞的增殖分裂密切相關。干細胞學說認為腫瘤干細胞（CSC）是腫瘤組織中具有自我更新、分化及增殖能力的特殊細胞。干細胞可以產生快速增生祖細胞群，針對干細胞及耐藥細胞的相關研究是目前腫瘤基礎研究熱點。尋找特異性的腫瘤干細胞標志物，對腫瘤干細胞進行靶基因干擾或分子靶向治療是眾多學者探索的方向。我們發現p75NTR高表達于Hep2細胞中的未成熟細胞和具有強分裂增殖能力的細胞，故喉鱗癌中的p75NTR陽性細胞可能包含有快速增生祖細胞群或干細胞群，p75NTR在終末分化的細胞中呈低表達，這與喉癌組織的相應染色結果相符合，同時也與國外舌鱗癌細胞系的研究結果相近[11]。我們研究發現，p75NTR對喉癌細胞生長和增殖具有促進支持的作用，p75NTR這種作用的發揮可能與喉癌中同時表達NGF及TrkA有關。Okumura等在食道鱗癌中有類似的研究結果，他們發現轉染p75NTR siRNA后引起食道鱗癌細胞系的增殖抑制和凋亡上升，認為p75NTR對食道鱗癌細胞的生長有支持作用，深入研究發現p75NTR陽性細胞與靜止期食道鱗癌干細胞比較接近[12]。

通過流式細胞儀檢測，我們發現喉癌Hep2細胞系中呈p75NTR強陽性的細胞比例僅為3.7%～6.2%左右。目前認為腫瘤CSC僅占腫瘤細胞的很小部分，卻是腫瘤起源、放化療后復發及轉移的根源[13]。研究腫瘤干細胞的特性，需要特異性的表面標記將其從其它細胞中分離出來。目前國內外相對公認CD133是頭頸部鱗癌腫瘤干細胞的標記物[14]，因此我們使用CD133抗體與p75NTR做流式雙標記檢測。雙向流式散點圖可見，p75NTR及CD133雙標陽性細胞比率僅為0.5%。其中大部分CD133強陽性細胞也呈p75NTR強陽性。因此，我們推測p75NTR強陽性Hep2細胞中包含有腫瘤干細胞及快速增生祖細胞群。免疫染色結果提示p75NTR蛋白表達的上調和細胞分裂增殖密切相關，是伴隨細胞增殖而上調p75NTR表達水平，還是p75NTR陽性細胞自身擁有強增殖活性，有待我們深入研究證實。p75NTR既能通過胞內死亡結構域等途徑激活凋亡通路，也能通過激活NFκB促進生存，充分說明其對細胞生存、分裂及凋亡的精確調控[15]。目前在喉癌組織細胞中，p75NTR依賴的促生存機制尚未闡明，我們推測p75NTR與喉癌細胞的增殖、分化、耐藥密切相關，探索如何通過p75NTR識別并殺傷喉癌腫瘤干細胞及耐藥細胞，為喉癌的綜合治療提供新的方向。

參考文獻：

[1]Cetin I，Topcul M.Cancer stem cells in oncology[J].BUON，2012，17（4）：644-648.

[2]Kalb R.The protean actions of neurotrophins and their receptors on the life and death of neurons[J].Trends Neurosci，2005，28（1）：5-11.

[3]Janet Alder，Wendy Fujioka，Anna Giarratana，et al.Genetic and Pharmacological Intervention of the p75NTR Pathway Alters Morphological and Behavioural Recovery Following Traumatic Brain Injury in Mice[J].Stem Cell Res，2014，12（3）：762-777.

[4]Barcelona PF，Saragovi HU.A Pro-Nerve Growth Factor （proNGF）and NGF Binding Protein，α2-Macroglobulin，Differentially Regulates p75 and TrkA Receptors and Is Relevant to Neurodegeneration Ex Vivo and In Vivo[J].Mol Cell Biol，2015，35（19）：3396-3408.

[5]Chen C，Shin JH，Eggold JT，et al.ESM1 mediates NGFR-induced invasion and metastasis in murine oral squamous cell carcinoma[J].Oncotarget，2016，7（43）：70738-70749.

[5]Jin JH，Pan Y，Zhao L，et al.p75 neurotrophin receptor suppresses the proliferation of human gastric cancer cells[J].Neoplasia，2007（9）：471-478.

[6]Khwaja F，Tabassum A，Allen J，et al.The p75NTR tumor suppressor induces cell cycle arrest facilitating caspase mediated apoptosis in prostate tumor cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，341（4）：1184-1192.

[7]Marchetti D，Aucoin R，Blust J，et al.p75 neurotrophin receptor functions as a survival receptor in brain-metastatic melanoma cells[J].J Cell Biochem，2004，91（1）：206-215.

[8]Okumura T，Tsunoda S，Mori Y，et al.The biological role of the low-affinity p75 neurotrophin receptor in esophageal squamous cell carcinoma[J].Clin Cancer Res，2006，12（17）：5096-5103.

[9]Soland TM，Brusevold IJ，Koppang HS，et al.Nerve growth factor receptor（p75NTR）and pattern of invasion predict poor prognosis in oral squamous cell carcinoma[J].Histopathology，2008，53（1）：62-72.

[10]申宇鵬，李曉明，耿江橋，等.神經生長因子受體TrkA在喉癌中的表達及意義[J].臨床誤診誤治，2009，22（05）：10-12.

[11]Tong D，Sun J，Huang P，et al.p75 neurotrophin receptor：A potential surface marker of tongue squamous cell carcinoma stem cells[J].Mol Med Rep，2017，15（5）：2521-2529.

[12]Kojima H，Okumura T，Yamaguchi T，et al.Enhanced cancer stem cell properties of a mitotically quiescent subpopulation of p75NTR-positive cells in esophageal squamous cell carcinoma[J].Int J Oncol，2017，51（1）：49-62.

[13]Schulenburg A，Blatt K，Cerny-Reiterer S，et al.Cancer stem cells in basic science and in translational oncology：can we translate into clinical application[J].Journal of Hematology&Oncology;，2015（8）：16.

[14]Wang K，Zhou XK，Wu M，et al.Role of CD133+cells in tongue squamous carcinomas：Characteristics of "stemness" in vivo and in vitro[J].Oncology Letters，2016，12（2）：863-870.

[15]Toni T，Dua P，van der Graaf PH.Systems Pharmacology of the NGF Signaling Through p75 and TrkA Receptors[J].CPT Pharmacometrics Syst Pharmacol，2014，3（12）：e150.

收稿日期：2018-7-19；修回日期：2018-7-29

編輯/楊倩