貧營養細菌固體菌劑發酵工藝的優化

張 娜， 趙 輝， 李雅楠， 馬 甜， 蘇建宇

(寧夏大學生命科學學院/西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏銀川 750021

近年來，由于農田大量的開墾、農業高強度的利用、過度放牧及自然災害等原因，導致土壤貧瘠化問題越來越普遍，給居民生活、工農業生產等帶來嚴重危害[1-2]。目前主要通過植物、化學及微生物修復途徑改良貧瘠土壤，努力恢復生態系統的功能已經成為目前研究的熱點之一。從根本上改善貧瘠土壤性狀，微生物改良是最佳的選擇，具有巨大的潛力，但目前尚未得到廣泛的研究及應用[3]。研究發現，貧瘠環境中存在對貧瘠極端環境具很強適應能力的貧營養菌，而對貧營養菌的研究主要基于水環境及醫療衛生等方面，關于對荒漠化、貧瘠化土壤的改良方面的研究卻鮮見報道。已有研究表明，貧營養細菌在干旱貧瘠環境中能夠很好地生長代謝，具解磷解鉀分泌大量胞外多糖等功能[4-7]，可有效穩定表層土壤顆粒，提高土壤肥力，為其他植物及微生物的生長提供營養物質，對干旱貧瘠土壤的改良具有重要意義[8]。功能微生物已被研制成固體菌劑廣泛應用，固體菌劑具生產成本低、環保、方便快捷等諸多優勢，而芽孢桿菌為其理想菌種資源[9-11]，芽孢具抗逆性強、易于保存與儲藏等優勢。固體菌劑發酵基質一般選擇廉價且來源廣泛的豆粕、米糠、黃豆餅粉、麩皮及其他微量元素[12-15]。我國每年農林業生產產生大量有機廢棄物，其中經焚燒等方式處理浪費的有機養分資源約有6 000萬t，嚴重污染環境，利用這些農林有機廢棄物作為固體菌劑發酵基質，不僅可以充分有效地利用有機養分資源、減少環境污染，而且可以改善土壤生物活性，提高土壤養分含量[11]，但采用農林有機廢棄物制備貧營養細菌固體菌劑的研究尚未見報道。本研究以實驗室前期分離保存的1株貧營養細菌為基礎，結合粉碎的桑樹枝條及棗樹枝條為主要基質，通過單因素試驗、正交試驗對貧營養細菌固體菌劑發酵工藝進行優化，并對優化后固體菌劑的養分含量進行測定，為其在生產上的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株，由筆者所在試驗室從干旱貧瘠土壤中分離篩選純化，為兼性貧營養細菌，經鑒定為枯草芽孢桿菌，產芽孢，命名為P4，具較強的解磷解鉀及產胞外多糖能力，在改良貧瘠土壤中具重要意義。

粉碎的棗樹枝條、桑樹枝條由寧夏回族自治區靈武市森保科技開發有限公司提供，過篩后分別混勻裝袋備用。硫酸銨[(NH4)2SO4]、氯化鈉(NaCl)、氯化鈣(CaCl2)、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)、磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)，均為分析純。

1.2 培養基

貧營養菌基本培養基：(NH4)2HPO41 g、KNO31 g、(NH4)2SO40.5 g、K2HPO4·3H2O 1.3 g、NaCl 5 g、MgSO4·7H2O 0.41 g、蒸餾水1 000 mL，pH值約為7.3，121 ℃高壓滅菌30 min。葡萄糖(配制成一定濃度的葡萄糖母液于115 ℃下單獨滅菌25 min，加入到貧營養菌基本培養基中使葡萄糖濃度為15 mg/L)，固體培養基加入15～20 g/L瓊脂粉。

平板計數培養基：采用NA培養基。基本固體發酵培養基：棗樹枝條60%(桑樹枝條 34.46%)、麩皮5%、NaCI 0.1%、K2HPO4·3H2O 0.1%、MgSO4·7H2O 0.02%、(NH4)2SO41%、CaCl20.01%。

1.3 試驗方法

本試驗于寧夏大學生命科學學院/西部特色生物資源保護與利用教育部重點試驗室中完成，試驗時間為2016年6—11月。

1.3.1 P4菌劑的基本發酵培養 保存的P4菌平板劃線活化菌種，接種環接種至液體培養基中(葡萄糖濃度為 15 mg/L)，在37 ℃、150 r/min下搖床振蕩培養24 h，為Ⅰ級種液；取2 mLⅠ級種液轉接至細菌基本培養基中(葡萄糖濃度為5 g/L)擴大培養48 h，為Ⅱ級種液，培養后的菌液D600 nm為1.4左右，菌量達1.81×108CFU/mL左右。

基本固體發酵培養基中pH值為7.0，料水比(質量比)1 ∶1.5 且接種量為15%，置于28 ℃恒溫培養箱中靜止培養2 d，每間隔12 h扣料1次，使其均勻生長，采用平板菌落計數法統計P4菌在固體發酵中的生長情況，設3個重復。

1.3.2 P4菌劑培養基條件的優化

1.3.2.1 單因素條件篩選試驗 分別以麩皮、棗樹枝條、(NH4)2SO4、NaCI、CaCl2、MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O添加量為單因素，編號分別為A、B、C、D、E、F、G。通過測定固體菌劑中活菌數及芽孢數量確定每種因素中較優水平。

1.3.2.2 正交試驗 在單因素試驗結果基礎上確定正交試驗分析的因素與水平，采用SPSS 19.0統計軟件設計正交試驗L27(313)優化培養基配方，正交試驗的因素水平見表1。以活菌數為指標，每個處理進行3次重復，為了證實正交試驗分析法的可靠性，在最佳培養基成分配比下對活菌數進行3次平行試驗。

表1 貧營養細菌P4菌劑培養基條件的優化正交試驗的因素水平

1.3.3 P4固體菌劑發酵條件的優化 在正交試驗確定培養基組分最優組合的基礎上，考察培養基厚度(0.5、1.5、2 cm)、料水比(1 ∶0.5、1 ∶1、1 ∶1.5、1 ∶2)、接種量(1%、5%、10%、15%、20%)及pH值(5、6、7、7.5、8) 4個培養條件對活菌數及芽孢的影響。

1.3.4 P4菌劑中菌數的測定 P4菌劑中菌數采用平板菌落計數法；芽孢數的測定：取培養好的固體菌劑，梯度稀釋后于80 ℃恒溫水浴10 min，取出后立即冷卻10 min，涂板培養48 h后進行計數。

1.3.5 固體菌劑養分含量的測定 全氮、灰分、總有機物及有機質含量的測定參照NY 525—2012《有機肥料》；堿解氮含量采用堿解擴散法測定[16]；纖維素、半纖維素、木質素含量參考文獻測定[17]。

1.3.6 數據分析 利用Excel 2010、SPSS 19.0軟件對試驗數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 P4固體菌劑培養基條件的優化

2.1.1 單因素試驗結果與分析 棗樹枝條中含纖維素、半纖維素及糖分等營養物質，固體培養基中添加量優勢較為明顯，圖1顯示，當培養基中棗樹枝條添加量為60%(即桑樹枝條添加量為34.46%)時，菌數達3.98×109CFU/g，與添加量為90%(桑樹枝條4.46%)時無顯著差異，但芽孢率達82.91%，顯著優于添加量為90%的組分。麩皮為芽孢桿菌菌劑制備中常用的原料，圖2顯示，在5%～10%范圍內培養基中菌數及芽孢率較高，當添加量為10%時，菌數達6.50×109CFU/g，芽孢率達 90.77%，顯著高于其他濃度。K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O參與細菌細胞壁的形成[18]，其中鎂離子是微生物生長代謝中必不可少的酶的激活劑，圖3顯示，培養基硫酸鎂添加量為0.10%時，菌數達7.50×109CFU/g，顯著高于其他組分；由圖4可知，K2HPO4·3H2O的添加量為0.5%時，菌數達4.40×109CFU/g，芽孢率達86.36%，顯著高于其他組合。已有學者研究表明，吡啶二梭酸鈣是活菌數形成芽孢的重要組成成分[18-19]，溶液中鈣離子促進芽孢的形成，但過量的鈣離子會與磷酸鹽反應生成不溶性沉淀，造成培養液中磷元素的損失，由圖5可知，當培養基中CaCl2的添加量為0.008%時，菌數達9.34×109CFU/g，芽孢率達90.94%，顯著高于其他組分。由圖6顯示，(NH4)2SO4添加量為0.5%時，菌數達4.00×109CFU/g，芽孢率達92.00%，顯著優于其他組合。由圖7可知，NaCl添加量為0.06%時，菌數達8.50×109CFU/g，芽孢率達89.88%，顯著優于其他組合。單因素試驗結果顯示，棗樹枝條、麩皮、MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O、CaCl2、(NH4)2SO4、NaCl的添加量分別為60%、10%、0.1%、0.5%、0.008%、0.5%、0.06%。

2.1.2 正交試驗結果與分析 采用SPSS 19.0統計軟件設計合適的正交試驗(表2)進一步優化培養基組分，方差分析見表3。通過正交試驗結果直觀分析表結果顯示，各因素對菌數影響程度的順序為：A>B>G>D>F>C>E，H為誤差項。根據各因素水平對應的平均值k可以推斷，采用方案A1B1C1D3E3F1G2可獲得較高的菌落數。方差分析表如表3所示：A的P值為0.017，B的P值為0.028，在α=0.05水平上均具有顯著性(P<0.05)，可見培養基中棗樹枝條及麩皮的添加量對固體菌劑中活菌數效果影響顯著，而C、D、E、F、G因素不具有顯著性(P>0.05)，最優組合為A1B1C1D3E3F1G2，得出結果與直觀分析結果一致。

表2 正交試驗結果直觀分析

正交最優組合為A1B1C1D3E3F1G2，即棗樹枝條30%(桑樹枝條64.46%)，麩皮5%，(NH4)2SO40.1%，NaCl0.08%，CaCl20.01%，MgSO4·7H2O0.05%，K2HPO4·3H2O0.5%。正交表中無最優項，后續試驗驗證最優組合菌數及芽孢率分別為3.45×1010CFU/g，芽孢率達94.45%，優于其他組合，驗證正交試驗的可靠性。

表3 正交試驗的方差分析

注：F0.95(2，10)=4.10，F0.99(2，10)=7.56

2.2 固體菌劑培養條件優化

2.2.1 培養基厚度對P4菌數的影響 由圖8可知， 培養基厚度對P4菌數影響較大，當培養基厚度為1.5cm時培養基P4菌數及芽孢數達到最大，菌數達12.5×109CFU/g，芽孢率達80.00%，顯著優于其他培養基厚度。培養基厚度太薄會加速水分的揮發，使得菌劑容易缺水，而當培養基厚度過厚時細菌生長過程中的二氧化碳及氧氣的擴散、營養物質的吸收及代謝產物的形成、酶的催化等都會受到阻礙[20]，所以培養基過厚會影響P4菌的正常生長代謝。綜上所述，最優培養基厚度選為1.5cm。

2.2.2 料水比對P4菌數的影響 含水量在固體發酵中會直接影響到菌體的正常生長、代謝，是一個非常關鍵的因素。圖9所示，隨著培養基中含水量的增加，P4菌數及芽孢率呈現明顯的上升趨勢，培養基中含水量太少，導致營養物質無法很好地溶解，固體基質膨脹度太低，菌體正常生長、代謝會受到抑制。培養基料水比為1 ∶1與1 ∶1.5培養基中的菌數無顯著差異，為了防止培養后期因水分的蒸發而使得菌數下降，選擇料水比為1 ∶1.5時為宜，菌數達 1.2×1010CFU/g，芽孢率達87.5%，而繼續增加水分會導致基質內透氣性差，使得氧氣不足，對菌體生長造成影響。

2.2.3 接種量對P4菌數的影響 由圖10可見，當菌液接種量在1%～15%時，P4菌數及芽孢率隨接種量的增大而上升，當接種量為15%時，菌數達8.00×109CFU/g，芽孢率達87.88%，顯著高于其他組分，但接種量繼續增大反而不利于菌體的生長。綜上所述，最優菌液接種量為15%。

2.2.4pH值對P4菌數的影響pH值會影響細菌細胞膜上的電荷，影響其對營養物質的吸收，合適的pH值會促進菌體的生長及代謝[21]。目前，由于固體發酵含水量一般較少，相對于液體發酵，其pH值難以檢測，一般選擇調節培養基的初始pH值。由圖11可見，pH值在5.0～7.0內隨著pH值增加，P4菌數及芽孢率均呈現上升趨勢，固體發酵最適pH值為7.0，菌數達1.5×1010CFU/g，芽孢率達80.00%，與劉喚明等的研究[22]相符，但當pH值繼續增加時，菌數及芽孢率均呈現下降趨勢。綜上所述，最適pH值為7.0。

2.3 最優條件下固體菌劑驗證

配制最佳培養基組成，培養條件選擇最優，優化后的固體菌劑菌數達4.5×1010CFU/g，芽孢率達94.57%，均顯著高于其他組分。

2.4 固體菌劑養分含量的測定

優化后的固體菌劑各養分含量為全氮 (18.30±0.035)g/kg，堿解氮(1.56±0.028)g/kg，灰分(10.45±0.207)%，纖維素(18.54±0.735)%，半纖維素(9.465±0.516)%，木質素(18.54±0.735)%，總有機物達(89.55±0.207)%。該固體菌劑養分含量均很高，有效改良干旱退化土壤。大部分微生物無法直接分解利用纖維素，半纖維素等營養物質，目前已通過從自然界直接篩選、原生質體融合育種、誘變育種及基因工程育種等方式獲得了多株降解枝條、作物秸稈等的微生物[23]，目前研究最多的為白腐真菌[24]。后期可采用經白腐真菌等高效降解菌處理過的粉碎枝條為固體基質，提高粉碎枝條的利用率。

3 結論與討論

諸多研究表明，固體菌劑可有效促進土壤養分的轉化、釋放及分解，固體菌劑包括不同具解磷解鉀及固氮等功能的細菌，可有效促進作物生長、提高土壤養分[25-26]。采用特殊環境中的貧營養細菌改造相應惡劣的生態環境，是目前一種新型改善土壤荒漠化、貧瘠化途徑[27]，貧營養細菌長期生存在貧瘠環境甚至更極端的環境中，對外界環境的變動性具強大的快速基因調控能力。本研究中的貧營養細菌為兼性貧營養菌，降低生產成本。固體基質主要選用粉碎的棗樹枝條和桑樹枝條，不但能有效解決枝條焚燒導致的環境污染問題，提高產業附加值，還可為制備固體菌劑提供新型的優質原料。

本試驗通過單因素試驗、正交試驗對貧營養細菌固體菌劑發酵工藝進行優化，并對優化后的固體菌劑各養分含量進行測定。通過正交試驗設計篩選出麩皮，棗樹枝條2個顯著影響菌體生長的關鍵因素，固體發酵最佳培養基組成為：棗樹枝條30%(桑樹枝條64.46%)，麩皮5%，(NH4)2SO40.1%，NaCl0.08%，CaCl20.01%，MgSO4·7H2O0.05%，K2HPO4·3H2O0.5%。優化培養條件為培養基厚度1.5cm，料水比 1 ∶1.5，接種量15%，pH值7.0。優化條件下菌數達4.5×1010CFU/g，芽孢率達94.57%，與其他學者采用玉米粉、豆餅粉等基質優化結果一致。優化后的固體菌劑養分含量為：全氮18.30g/kg，堿解氮1.56g/kg，灰分10.45%，纖維素 18.54%，半纖維素9.465%，木質素18.54%，總有機物達 89.55%。本研究為該菌劑開發及應用提供了理論基礎。該固體菌劑可對貧瘠土壤的理化性質、持水性有一定的改善，后續須試驗驗證固體菌劑對貧瘠土壤的改良效應，此外在工業化生產中很難達到實驗室小試效果，今后迫切須要解決如何使工業化生產達到小試效果的問題。