不同產區皺皮木瓜總黃酮含量與土壤主要化學指標的關系

鄭 璇， 申國明， 高 林， 張 鵬， 李琦瑤， 李盼盼， 劉新民

(1.中國農業科學院煙草研究所，山東青島 266101； 2.中國農業科學院研究生院，北京 100081

植物體內次生代謝產物多與植物的抗逆性、抗病性相關，其合成和積累受環境因子影響。傳統中醫認為，環境因子間的差異對中藥材道地性的形成起重要作用。在眾多環境因子中，土壤占較大比重[1]。因此，探究土壤主要化學指標對植物次生代謝產物合成和積累的影響對藥材質量評價具有重要意義。

皺皮木瓜是薔薇科植物貼梗海棠[Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai]的干燥近成熟果實，因其果實曬干后外表皮皺縮而得名。皺皮木瓜是一種重要的藥食同源植物，具有保肝、抗腫瘤以及抗炎鎮痛等功效[2]，在我國主要分布于安徽、湖北、云南、重慶、四川、浙江、貴州等地。木瓜中黃酮類物質對皺皮木瓜藥理活性有重要的作用。近年來，對黃酮類物質的研究開始成為熱點。黃酮類化合物可作為電子供體發揮抗氧化作用，從而有效降低腫瘤、心腦血管疾病等慢性病的發生[3]。目前，對皺皮木瓜的研究主要集中在不同產區[4]、不同采收期[5-6]木瓜藥材所含的化學成分以及對其活性成分的分離提取[7]，木瓜總黃酮與土壤化學指標的相關研究還未見報道。本試驗結合生產實際，通過對不同產地皺皮木瓜總黃酮含量與土壤pH值、有機質含量、全氮含量、速效鉀含量、速效磷含量進行相關分析，探究影響皺皮木瓜質量的土壤因素，揭示土壤在道地藥材形成中的作用和不同產區皺皮木瓜差異形成的原因，為木瓜品質評價和生產提供理論指導和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

槲皮素對照品，純度95%，Adamas公司；福林-西奧卡特(Folin-Ciocalteu)試劑，Sigma公司；甲醇、乙醇，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；亞硝酸鈉(NaNO2)，國藥集團化學試劑有限公司；三氯化鋁(AlCl3)，阿拉丁公司。

SBL-30DT型超聲波恒溫清洗機，浙江寧波新芝生物科技股份有限公司；Multiskan Fc型酶標儀，賽默飛世爾(上海)有限公司；BSA124S-C型電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；FP6410型火焰光度計，上海精科分析儀器廠；循環水式多用真空泵，河南鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 試驗材料

供試皺皮木瓜樣品分別來自中國道地產區：安徽宣城、重慶綦江、湖北長陽、浙江淳安、云南臨滄，采樣于各產區木瓜采摘期進行(2017年7—9月)。在各產區的果園內隨機選取生態條件基本一致的同齡實生皺皮木瓜植株各5株，每個植株選取大小一致且成熟度相近的果實各3枚，將采集的木瓜樣品對半剖開，并在日光下暴曬10 d，粉碎、過篩(粒徑 0.25 mm)，干燥保存。采集相應點的土樣，將土壤樣品置于干燥、通風、潔凈的室內陰干，剔除雜質，撿去動植物殘體，將土壤研細，過篩(粒徑2 mm)，干燥保存。

1.3 試驗方法

1.3.1 木瓜樣品總黃酮的提取和含量測定

1.3.1.1 提取方法 參考王曉麗的方法[8]并稍作改動。稱取木瓜樣品0.1 g于20 mL具塞玻璃管中，精確稱定，加入90%乙醇10 mL，混勻，于60 ℃下超聲(功率為360 W)50 min；過濾，殘渣根據以上方法再次提取1次，合并2次濾液，搖勻即得樣品提取液。

1.3.1.2 槲皮素標準曲線的繪制 以槲皮素為標準品配制標準溶液，選取槲皮素對照品溶液含量分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL。用酶標儀于510 nm測量吸光度。以槲皮素含量(C)為橫坐標，吸光度(D)為縱坐標繪制標準曲線，其回歸方程為D=0.495C+0.035 7(r2=0.999)。槲皮素對照品溶液在0.1～1.2 mg/mL范圍內呈線性關系(圖1)。

1.3.1.3 總黃酮含量測定 吸取10 μL 50 mg/mL亞硝酸鈉(NaNO2)溶液于96孔板中，加入50 μL待測液，充分混勻后于室溫下反應5 min，加入10 μL 100 mg/mL的氯化鋁(AlCl3)溶液，充分混勻，室溫反應1 min，最后加入100 μL 0.5 mol/L 氫氧化鈉(NaOH)溶液，用酶標儀于510 nm處測定吸光度。通過標準方程得出樣品中的總黃酮含量。

1.3.2 土壤主要化學指標的測定 土壤主要化學指標的測定方法參照常規土壤化學分析方法進行測定[9]。土壤pH值在5 ∶1水土比的土壤懸濁液中用酸度計測定；全氮含量采用凱氏定氮法測定；速效鉀含量采用醋酸銨-火焰光度計法測定；速效磷含量采用0.5 mol/L碳酸氫鈉(NaHCO3)浸提-鉬銻抗比色法測定。

1.4 數據處理

試驗數據采用Statiscal Analysis System 9.2進行相關性分析和逐步回歸分析。

2 結果與分析

2.1 不同產區木瓜總黃酮含量測定

本試驗表明，在所選的5個產區中，各產區木瓜的總黃酮含量差異較大(圖2)，其中云南臨滄的木瓜總黃酮含量最高，為(34.79±0.20) mg/g，這與王有為等的研究結果[10]類似；重慶綦江的木瓜總黃酮含量最低，為(6.32±0.60) mg/g。這表明木瓜黃酮含量的積累與產區相關。木瓜總黃酮含量的差異顯示不同產區的木瓜質量可能有所不同。俞佳比較了7個產區(四川、湖北、安徽、云南、貴州、浙江、廣元)皺皮木瓜的總黃酮含量，其中四川、浙江、廣元這3個地區木瓜總黃酮含量較高[11]。不同的試驗方法、采樣時期、采樣地點等因素都會造成木瓜總黃酮含量的差異。因此，不同產區木瓜總黃酮含量并不是一成不變的，藥材的道地性可能受多種因素共同影響。

2.2 不同產區土壤主要化學指標測定

木瓜不同產區土壤的pH值、有機質含量、全氮含量、速效鉀含量、速效磷含量均存在一定差異(表1)。皺皮木瓜種植地區土壤呈中性或弱酸性，各樣地土壤有機質含量最高為最低的5.85倍，全氮含量最高為最低的為4.84倍，速效鉀含量最高為最低的為30.91倍，速效磷含量最高為最低的為15倍。土壤氮、磷、鉀的含量與植物的生長密切相關，重慶、浙江、湖北全氮含量較高，安徽、云南速效鉀含量較高，安徽地區速效磷含量較高。不同產區土壤之間的差異，說明皺皮木瓜適應力強，適于人工集約化栽培。

在各種環境因子中，土壤對藥材質量的影響起到了不可忽視的作用[12]，植物體內次生代謝物的產生和運輸直接或間接受到土壤因子的影響。在不同產區，即使栽培措施和氣候條件相同，土壤環境的不同也會造成植物體內代謝產物不同。一些植物次生代謝產物會受到土壤pH值的影響[13]，有機質含量是衡量土壤肥力的重要指標，土壤中的速效鉀[14]、全氮、速效磷等含量均會影響植物中總黃酮的含量。孔璐等均選用了本試驗選取的幾種指標作為評價黃酮和木瓜質量的影響因子[15-16]，因此本試驗選取的化學指標可較好地評價皺皮木瓜的質量。

表1 不同產區土壤主要化學指標

注：同列數據后不同字母表示不同產區之間差異顯著(P<0.05)。

2.3 總黃酮含量與土壤主要化學指標的相關性分析

通過分析總黃酮含量與土壤各因子之間的相關性可以揭示各指標間的聯系。本試驗選取具有代表性的5種土壤化學指標(pH值、有機質含量、全氮含量、速效鉀含量和速效磷含量)，它們可較好地反映土壤肥力的狀況。由表2可知，總黃酮含量與土壤中有機質含量、速效鉀含量呈極顯著正相關關系(P<0.01)，與全氮含量呈極顯著負相關關系，與速效磷的含量呈顯著正相關關系(P<0.05)。因此， 皺皮木瓜總黃酮含量受土壤中多個因子的共同影響。

表2 總黃酮含量與5個土壤化學指標的相關系數

注：*、**代表相關顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

藥用植物所接受到的光照、溫度、水分和土壤等因素會對植物的長產生重要的影響。土壤因子影響植物的次生代謝物的合成和積累，進而影響藥材品質。不同植物對土壤pH值的響應不同。在某些植物中，土壤pH值與活性成分含量無明顯相關性[17]；本試驗結果中，土壤pH值對木瓜總黃酮含量無顯著影響。土壤中有機質可以促進土壤微生物生長，進而活化土壤養分，土壤中有機質含量的提高有利于總黃酮的代謝積累；本試驗中，土壤中的全氮含量與總黃酮含量呈極顯著的負相關關系，說明土壤中全氮含量越多，越不利于皺皮木瓜總黃酮的合成和積累，這與“碳素/營養平衡假說”中的觀點[18]一致，即環境中的碳/氮(C/N)比可以調節植物體內次生代謝產物合成和積累，一些以氮為基礎的次生代謝產物與植物體內的碳氮比呈負相關關系，一些以碳、氫、氧為基礎的與碳氮比呈正相關關系[19]。植物中的一些營養元素主要來源于土壤，因此土壤對植物氮素的供應量也會影響植物體內的次生代謝物質的積累。大量研究表明，土壤中氮含量低時更有利于次生代謝產物的合成和積累[20]。本試驗中，土壤中的速效鉀和速效磷含量與木瓜中總黃酮含量呈正相關。栽培過程中合理施肥，在一定范圍內增加土壤中鉀和磷的含量，可以在一定程度上提高木瓜的抗逆性和對外界環境的適應能力[21]，同時增加木瓜中總黃酮的含量。

2.4 回歸模型的建立

為建立總黃酮含量與其他各土壤化學指標關系的數學模型，本試驗以總黃酮含量(TF)為因變量、以各土壤化學指標為自變量進行逐步回歸分析，得到方程：

TF=3.984+1.177OM+62.223AK(P<0.01)。

(1)

式中：OM為有機質含量，AK為速效鉀含量，復相關系數R=0.999 4，F=1 668.51。

由公式(1)可知，在5個土壤化學指標中有2個指標對皺皮木瓜總黃酮含量有顯著影響，分別是有機質含量和速效鉀含量，復相關系數較高，表明了土壤化學指標對木瓜黃酮含量的影響，說明以上2個指標可較好地解釋總黃酮的含量。

將土壤化學指標與總黃酮含量通過逐步回歸分析得到了2個顯著影響皺皮木瓜總黃酮含量的單項指標，同時得到總黃酮含量評價數學模型，可預測不同產區皺皮木瓜總黃酮含量的差異，這對皺皮木瓜品質評價有一定科學性和預見性。

皺皮木瓜是我國傳統的藥食同源植物，藥用歷史悠久，而且作為一種功能食品具有很大的發展潛力，它營養、藥用價值豐富，現已開發出木瓜酒、木瓜果脯[22]等廣受消費者喜愛的食品。皺皮木瓜種植適應性強，適合在多數地區種植[23]，然而目前對皺皮木瓜質量的影響因子缺乏深入研究[24]，從而不能對木瓜的科學管理提供技術支持，這在一定程度上限制了木瓜產業的發展。

本試驗結果表明，木瓜總黃酮含量與土壤中的有機質、全氮、速效鉀含量密切相關。除pH值和全氮含量外，其他3個化學指標均與總黃酮含量呈正相關。這與吳丹等對魚腥草的研究結果[25]類似。覃容貴等對寬葉纈草總黃酮含量與根際土壤理化性質進行相關分析發現，總黃酮含量與有機質、速效鉀和速效磷含量呈負相關[26]，與全氮含量呈正相關，這可能與植物的種類有關，也可能是因為一定條件下對藥材生長發育有利的土壤條件對于次生代謝產物的積累反而不利[27]。

筆者通過木瓜總黃酮含量與土壤主要化學指標相關性分析，結合實際生產對木瓜品質的提高提出建議：皺皮木瓜的生長適合偏酸性或中性的土壤，在栽培過程中合理施肥，適當地多施磷肥、鉀肥，培肥地力，控制土壤中氮肥的用量，疏松土壤，增加土壤酶活性和微生物比例，對于木瓜品質有較好改善。

3 結論

采用紫外分光光度法測定5個產區皺皮木瓜的總黃酮含量，其中云南臨滄產區木瓜總黃酮含量最高，其次為安徽宣城、湖北長陽、浙江淳安，重慶綦江最低。通過相關分析可以看出，木瓜總黃酮含量與有機質、速效鉀含量呈極顯著正相關，與速效磷含量呈顯著正相關，與全氮含量呈極顯著負相關。有機質、速效鉀含量可作為評價木瓜總黃酮含量的參考指標。不同產地間皺皮木瓜總黃酮含量的差異是產地間生境土壤和其他生態因子的不同以及遺傳變異共同作用的結果，植物體內代謝物質的合成及積累也與植物自身發生的生理生化變化有關，對總黃酮含量的影響是多因素綜合作用的結果，本試驗測定了不同產區總黃酮含量與土壤條件的差異，探明了土壤的5種化學指標對木瓜總黃酮含量影響，為以后更深入研究影響木瓜質量的相關因子提供了借鑒和基礎。