雜交蓮瓣蘭根狀莖增殖和分化技術研究及分子鑒定

劉 祥，孫東玲，卓素卿，歐陽明安

(福建農林大學生物農藥與化學生物學教育部重點實驗室，福建福州 350000

蓮瓣蘭(Cymbidiumtortisepalum)別稱菅草蘭、卑亞蘭、小雪蘭[1]，為蘭科蘭屬多年生草本植物。曾被歸入春蘭之下作為變種，但因兩者形態差異較大，最終恢復承認蓮瓣蘭為獨立的種[2]。“蓮瓣”是對蘭花瓣型的描述，蓮瓣蘭的花形像荷花，蓮瓣即荷瓣，故因此得名[3]。蓮瓣蘭原產于云南西北部的三江并流流域，分布范圍十分狹窄，主要見于滇西北、川西南和臺灣等地[4]。一般生長在常綠松櫟林和灌木混交林下，土壤中性，喜背陰坡和疏松的腐質土[5]，是中國傳統蘭花中最具云南特色的品種。

20世紀80年代起，以韓、日和我國臺灣為中心的東南亞國家和地區蘭市暴熱，1株中檔國蘭的價值在數百至數千元人民幣之間，珍稀蘭花價值更逾百萬元，蓮瓣蘭作為國產蘭屬中的重要一員，逐漸被國內蘭界所熟知。目前已形成素花、奇花、瓣型花、復色花、線藝、矮種等系列的優良品種[6]，因其葉態多姿(直立或半直立)，葉長和葉寬有較大差異，花色豐富(白色、綠色、紅色、黃色等)，瓣型各異[7]，深受中國、日本、韓國和東南亞等國家人民的喜愛，具有極高的觀賞價值、文化價值和經濟價值。

但是由于全球“蘭花熱”和經濟利益驅使，近20年，瓣蘭種質資源遭到了毀滅式采挖[8]，導致其數量急劇減少，自然界中很難再找到開花的成年植株。生存環境的破壞導致其無法在自然界中正常地繁衍和生存，野生種質資源瀕臨滅絕。而蓮瓣蘭種子的胚多發育不完全或不成熟，甚至不含胚乳，因此直接用種子萌發來獲得植株較為困難[9]。而傳統的分株繁殖，種苗增殖緩慢，分株移栽過程易被病毒感染，品種退化嚴重[10]，因此采用植物組織培養技術進行快速大量繁殖，對于解決蓮瓣蘭繁殖系數低等問題，同時推動大規模商業化生產是一種極為可行的方法。本試驗以蓮瓣蘭大雪素為母本，墨蘭為父本進行雜交，產生的后代根狀莖為材料，研究不同因素對雜交蓮瓣蘭根狀莖增殖的影響，并對其進行分子鑒定，以期為提高蓮瓣蘭育種質量和大規模商業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為雜交蓮瓣蘭蒴果，其由父本墨蘭(Cymbidiumsinense)的花粉涂抹于母本蓮瓣蘭大雪素(Cymbidiumtortisepalum‘Daxuesu’)的子房柱頭上并套袋發育獲得(2014年12月人工授精，2015年7月獲得蒴果，地點在福建農林大學英龍2號樓天臺)。

1.2 方法

1.2.1 雜交根狀莖的誘導 將蒴果表面消毒后剖開，取出蘭花種子撒在1/2 MS培養基上，暗培養10 d后轉入光照培養。培養條件：溫度25 ℃，光照度2 400 lx，時間12 h/d，濕度75%，待種子萌發后轉移到新的培養基上進行擴增，為后續試驗積累材料。

1.2.2 不同基本培養基對根狀莖增殖的影響 根狀莖的增殖是蓮瓣蘭快速繁殖的關鍵，而基本培養基的成分則會直接影響到根狀莖的生長狀況，試驗選取了MS、1/2MS、B5、N6共4種培養基進行比較，培養基中另外添加1 mg/L萘乙酸(NAA)+1 mg/L 6-芐基氨基嘌呤(6-BA)+30 g/L蔗糖+1 g/L活性炭+1 g/L胰蛋白胨+7 g/L瓊脂。在無菌條件下，將根狀莖掰成小塊放入培養基中，每瓶放4根，每個處理重復5次，培養前后記錄鮮質量和根狀莖分枝數。

1.2.3 不同NAA濃度對根狀莖增殖的影響 試驗在N6基本培養基上進行，設置6-BA的濃度為1.0 mg/L固定不變，激素NAA的濃度梯度為0、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mg/L，培養基中另外添加30 g/L蔗糖+1 g/L活性炭+1 g/L胰蛋白胨+7 g/L瓊脂。每瓶放置4根材料，每個處理重復4次，培養前后記錄鮮質量和根狀莖分枝數。

1.2.4 不同6-BA濃度對根狀莖增殖的影響 試驗在N6基本培養基上進行，設置NAA的濃度為1.0 mg/L固定不變，激素6-BA的濃度梯度為0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L，培養基中另外添加30 g/L蔗糖+1 g/L活性炭+1 g/L胰蛋白胨+7 g/L瓊脂。每瓶放置4根材料，每個處理重復4次，培養前后記錄鮮質量和根狀莖分枝數。

1.2.5 不同碳源對根狀莖增殖的影響 培養基中添加糖類是為植物組織細胞生長提供碳源，也可以提高培養基的滲透壓。本試驗對蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麥芽糖6種糖類進行篩選，濃度均為30 g/L，并以試驗得到的最佳基本培養基N6和最佳激素搭配0.5 mg/L NAA+0 mg/L 6-BA為定值，另外添加1 g/L活性炭+1 g/L胰蛋白胨+7 g/L瓊脂。每瓶放置4根材料，每個處理重復5次，培養前后記錄鮮質量和根狀莖分枝數。

1.2.6 不同有機添加物對根狀莖增殖的影響 蘭花組織培養過程中常常添加一些天然有機物，這些有機物成分復雜，研究表明，它們對根狀莖的增殖和分化有明顯的促進作用[11]。試驗選取了椰子汁、蘋果汁、馬鈴薯勻漿、西紅柿勻漿、蛋白胨和胰蛋白胨6種天然復合物進行測試，其添加濃度分別為椰汁100 mL/L、蘋果汁100 mL/L、馬鈴薯勻漿100 g/L、西紅柿勻漿100 g/L、蛋白胨1 g/L、胰蛋白胨1 g/L。培養基中其他成分為N6+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+1 g/L活性炭+7 g/L 瓊脂。每瓶放置4根材料，每個處理重復4次，培養前后記錄鮮質量和根狀莖分枝數。

1.2.7 不同活性炭濃度對根狀莖增殖的影響 組織培養中添加活性炭有吸附有毒代謝物和調節激素釋放的作用，可以有效促進植物的生長。本試驗測試0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L 共6個活性炭濃度水平，培養基中其他成分為N6+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂。每瓶放置4根材料，每個處理重復4次，培養前后記錄鮮質量和根狀莖分枝數。

1.2.8 不同激素濃度搭配對根狀莖分化的影響 前人研究表明選用恰當的植物激素配比對根狀莖的分化起著主導作用[12]。本試驗選取9個激素組合探究對根狀莖發芽的影響(表1)，培養基中其他成分為N6+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂。每瓶放置5根材料，每個處理重復4次，培養前后記錄鮮質量、根狀莖分化個數和總出芽數。

表1 分化試驗激素組合

1.2.9 試驗培養基條件及統計分析計算方式 以上“1.2.2”節至“1.2.8”節試驗中的培養基pH值5.4～5.8，培養溫度(25±2) ℃，相對濕度70%～80%，光照度2 400 lx，增殖過程光照時間12 h/d，培養時間為30 d，分化過程光照時間14 h/d，培養時間為120 d(時間從2016年3月至2017年4月，在福建農林大學英龍2號樓2樓植物組培室進行)。實驗分析計算公式具體如下：

增殖率=(培養后分枝數-培養前分枝數)/培養前分枝數×100%；

鮮質量增長率=(培養后鮮質量-培養前鮮質量)/培養前鮮質量×100%；

分化率=分化根狀莖數/5×100%；

平均出芽數=總出芽數/根狀莖分化個數。

1.2.10 雜交蓮瓣蘭的分子鑒定 取根狀莖誘導長出的小苗葉片作材料，通過植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取基因，并擴增其ITS片段，PCR體系如表2所示。

表2 PCR反應體系的組成

然后通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR產物，可用后進行回收，樣品送至鉑尚生物技術(上海)有限公司進行測序。最終將測序結果放在NCBI網站上進行比對，并下載10個相近的序列運用MEGA 5.05構建系統發育樹探究其親緣關系。

1.2.11 數據分析 試驗數據采用Excel進行記錄，采用SPSS 19.0進行數據分析并作圖，采用Duncan’s新復極差法進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 雜交根狀莖的誘導

蘭花種子內的球形胚發育不完全且無胚乳，加之致密種皮的透性差和種皮上含有抑制萌發的物質，自然條件下萌發困難。本試驗將蘭花種子撒在培養基上控溫控濕，一段時間后種子吸水開始膨脹，在150～180 d內觀察到種子萌發并逐漸形成根狀莖，接著將根狀莖轉移到相同培養基上進行擴增(圖1)。

2.2 不同基本培養基對根狀莖增殖的影響

將根狀莖接種在不同基本培養基上培養30 d后，可以肉眼觀察到根狀莖上新長出的白色或綠色的幼嫩側枝，這說明不同培養基中的根狀莖均有側枝增加。通過對培養前后鮮質量的數據統計，由圖2可知，在4種基本培養基培養條件下，無論是根狀莖增殖率還是鮮質量增長率的差異都比較明顯。在1/2MS上培養的根狀莖增殖率最高，說明此培養基能夠有效促進根狀莖側枝的生長，但是與N6培養基相比差異并不顯著，另外其鮮質量增長率最低，可以說明1/2MS不利于根狀莖質量的增加。在N6培養基上培養的根狀莖鮮質量增長率在4種基本培養基中最高，說明其有利于根狀莖的增粗增大，增殖率方面比1/2MS略少，但差異不大，其他2種培養基MS和B5促進根狀莖側枝和鮮質量增加的效果均一般，所以綜合2種生長指標來看，N6培養基為最佳選擇。

2.3 不同NAA濃度對根狀莖增殖的影響

生長素在根狀莖增殖過程中起著至關重要的作用。本試驗設置6-BA為固定濃度，研究NAA不同濃度下根狀莖的生長情況。從數據分析得出的折線圖(圖3)可以看出，根狀莖的增殖率和鮮質量增長率隨著NAA濃度的不斷增大呈現出明顯的波動狀態。在不同處理中，當NAA濃度為 0.5 mg/L 時，根狀莖鮮質量增長率最高，說明在此條件下根狀莖增粗增大的幅度最大，此濃度最有利于根狀莖有機物質的積累，但增殖率較低，說明不利于側芽的生長，與此情況相近的濃度為5.0 mg/L，其增殖率和鮮質量增長率與0.5 mg/L水平差異并不明顯。當NAA濃度為4.0 mg/L時，根狀莖增殖率最高，其鮮質量增長率較之其他濃度一般，那么在培養過程中，可以根據需求的不同選擇相應的生長素濃度，以便對根狀莖有側重地進行培養。

2.4 不同6-BA濃度對根狀莖增殖的影響

細胞分裂素搭配生長素使用可以更好地促進根狀莖的增殖。本試驗設置NAA為固定濃度，選取6個不同的6-BA濃度水平，測定其不同濃度對根狀莖增殖的影響。圖4顯示，增殖率和鮮質量增長率都隨著6-BA濃度的改變而呈現出相似的趨勢，即6-BA濃度小于2.0 mg/L時，整體上為下降趨勢，6-BA濃度為2.0 mg/L時，增殖率和鮮質量增長率均為最低，6-BA濃度>2.0 mg/L后，增殖率和鮮質量增長率開始增加。整體看，無論是增殖率還是鮮質量增長率都以 6-BA 濃度為0時最佳，只是鮮質量增長率與濃度0.5、1.0 mg/L 水平相比差異不顯著，但增殖率卻達到了極顯著差異(P<0.01)，說明雜交蓮瓣蘭根狀莖的培養只添加NAA即可，6-BA的存在會不同程度地降低增殖效率。

2.5 不同碳源對根狀莖增殖的影響

蘭花組織培養中應用較多的是蔗糖和葡萄糖，添加糖類物質主要是增加培養基中的滲透壓，本試驗除了這2種外，又增加了乳糖、果糖、木糖和麥芽糖4種碳源進行測試。圖5顯示，6種碳源中果糖對雜交蓮瓣蘭根狀莖的側枝和鮮質量的促進作用均為最佳，這與前人關于碳源對根狀莖增殖影響的研究結果有所不同，可能跟蓮瓣蘭的植物特性以及雜交因素相關。另外側枝增加效果接近果糖的碳源分別為蔗糖和葡萄糖，但是培養基中添加蔗糖和葡萄糖，蓮瓣蘭根狀莖鮮質量增長率與果糖相比差距較大，而蔗糖和葡萄糖2種糖類間差異并不顯著。增殖效果最差的為乳糖，增殖率和鮮質量增長率均為最低。

2.6 不同有機添加物對根狀莖增殖的影響

天然復合物的成分一般比較復雜，以往的研究發現這些外來添加物可以有效地促進蘭花組織增殖。本試驗測試了椰汁、蘋果汁、馬鈴薯、西紅柿、蛋白胨和胰蛋白胨6種天然復合物，并設置1個空白對照(不添加復合物)。由圖6可以看出，在添加蛋白胨的培養基上生長的根狀莖增殖率最高，說明培養材料分枝最多，其次為空白對照，兩者差異不顯著，而空白對照的鮮質量增長率最高，說明在此條件下根狀莖有機物積累速度最快，生長粗壯，不過與蛋白胨相比差異也不顯著。

總體看，不加任何天然復合物的培養基對根狀莖增殖效果最佳，而添加了復合物的培養基其促增殖作用大部分有不同程度的降低，說明添加復合物對此雜交蓮瓣蘭根狀莖不利，對其生長會產生一定的阻礙作用，雖然蛋白胨、胰蛋白胨和椰汁等與空白對照的增殖效果相近，但考慮培養成本因素，最終確定不添加任何天然復合物為最佳條件。

2.7 活性炭不同濃度對根狀莖增殖的影響

活性炭對于調節培養基中有機物和植物生長調節劑的濃度具有十分重要的作用，本試驗設置了6個濃度梯度測試其對根狀莖增殖的影響。從圖7可以看出，蓮瓣蘭根狀莖增殖率和鮮質量增長率隨著活性炭濃度的提高也發生較大的波動，不加活性炭時根狀莖鮮質量增長率最高而增殖率最低，表明在此條件下根狀莖有機物積累快但側枝增長較少。活性炭濃度為5.0 g/L時根狀莖側枝生長最快，其鮮質量增長速度略低于不加活性炭時的水平，且差異不顯著，其他活性炭濃度下，根狀莖的生長均處于一般水平，因此培養基中添加活性炭的最適濃度應為5.0 g/L。

2.8 不同激素濃度搭配對根狀莖分化的影響

目前最常用的激素是生長素和細胞分裂素，不同的濃度、種類和組合所起的作用不同。有關資料顯示，蘭花培養材料的分化一般需要較低濃度的生長素和高濃度的細胞分裂素搭配。本試驗設置了9組激素配比進行測試，圖8和圖9分別表示不同激素配比組合對雜交蓮瓣蘭根狀莖增殖和分化的影響。從圖8中可以看出組合二(0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA)的分化率最高，接近100%，說明此種激素配比對根狀莖分化影響最為顯著，可以有效地促進雜交蓮瓣蘭根狀莖快速發芽，其次是組合一(0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA)和組合三(0.5 mg/L NAA+4.0 mg/L 6-BA)的分化率較高，組合二與組合一差異不顯著，與組合三差異顯著(P<0.05)。另外從圖8上看前3個組合的分化率明顯比其他組合高很多，而它們的NAA濃度都為0.5 mg/L，說明較低濃度的NAA有利于雜交蓮瓣蘭的分化，這與前人研究結果相一致。結合圖9可知，組合二的平均出芽數也較高，與最高者差異不顯著，所以確定組合二為最佳促分化激素搭配。圖9顯示組合九(2.0 mg/L NAA+4.0 mg/L 6-BA)平均出芽數最高，說明高濃度的激素搭配能促使單個根狀莖分化時出芽數量多，所以可以考慮將已經分化的根狀莖轉移到添加此激素配比的培養基上促進芽數量的增加，最終達到蓮瓣蘭苗又快又好生長發育的目的。

2.9 雜交蓮瓣蘭的分子鑒定

提取的DNA經過通用引物ITS1和ITS4擴增后，其ITS片段擴增電泳圖見圖10。圖10顯示雜交蓮瓣蘭的ITS片段大小接近750 bp，擴增的產物可以直接從PCR反應液中回收，然后送至鉑尚生物技術有限公司測序，獲得相應序列，正向序列大小為698 bp，反向序列大小為723 bp。登陸NCBI網站Blast并下載相近序列， 再使用MEGA5.05軟件構建系統發育樹(圖11)。網站搜索顯示最近的序列其相似度僅為96%，從構建的系統發育樹上看此雜交種與選取的10種蘭花都不在同一分支上，說明與它們的親緣關系較遠，而本株蘭花是由蓮瓣蘭和墨蘭接種雜交而成，之所以造成這種現象應該與雜交后代基因發生較大改變有關，總體說明此植株應為雜交后代。

3 討論與結論

不同種蘭花材料進行組織培養所需要的基本培養基和激素等物質是不同的，而同一種蘭花材料在不同培養階段需要的培養條件也不盡相同，因此對于具體的蘭花品種及材料，培養條件的篩選是一項十分艱巨的任務。在蘭花組織培養方面，通常對于春蘭、寒蘭、建蘭和墨蘭等研究較多，而對蓮瓣蘭的研究相對偏少，對于雜交品種的研究相比純種也較少，所以往往在這些方面缺乏參考的依據。另一方面，由于蘭花種子萌發率低[13]，苗株生長周期長等問題制約了蘭花的工廠化生產，雜交不失為一種生產新品種的手段，但是親緣關系近的品種間容易雜交成功，而親緣關系遠的品種間就不容易獲得成功[14]。在蘭花組織培養過程中，基本培養基和激素對其影響往往最大，前人對其研究也最多[15]，其次就是碳源、添加物和活性炭等方面，所以要找出最優組織培養條件，任重而道遠。

本試驗選取基本培養基，從NAA、6-BA、碳源、有機添加物和活性炭共6個方面進行最佳培養條件的篩選。綜合考慮增殖率、鮮質量增長率、分化率和平均出芽數4個生長指標，確定N6培養基為最佳基本培養基；NAA濃度為0.5 mg/L有利于根狀莖鮮質量的增加，為4.0 mg/L則有利于側枝的生長；對碳源的選取以果糖效果最佳，這與以往的研究結果相比差異較大，可能跟植株的品種不同相關；不加天然復合物既有利于雜交蓮瓣蘭根狀莖的增殖，又可以節約培養成本；活性炭濃度為5.0 g/L可以高效地促進根狀莖的生長；0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA激素組合能夠使根狀莖快速分化，2.0 mg/L NAA+4.0 mg/L 6-BA激素組合可以使分化的根狀莖產生更多的芽，2個激素組合如果在誘芽過程中搭配使用效果更好，最終可獲得大量的幼苗，為后續移栽和誘花研究提供豐富的材料。雜交蘭苗株的形態往往表現出父本和母本中和或者偏向于某一親本的現象，由于周期較長，本試驗未能從花型等特征進行辨別，而選取分子鑒定手段確定其為雜交品種。