Ca2+和四環素類抗生素單體、復合溶液及土壤解吸液對白菜種子萌發和根芽伸長的影響

朱秀輝， 丁 丹， 茹淑玲， 檀 笑， 解啟來， 鄧春軍， 曾巧云

(1.華南農業大學資源環境學院，廣東廣州 510642； 2.環境保護部華南環境科學研究所，廣東廣州 510655

抗生素作為促生長劑和預防、治療人類及畜禽等動物疾病的特效抗菌藥而在全球范圍內廣泛使用。但這些抗菌藥有 30%～90% 不能被機體的組織細胞吸收，以藥物原液或其代謝物的形成隨糞便排出[1]。畜禽糞便作為有機肥料是目前改善耕作土壤的主要和最有前景的方法之一[2]，廣泛應用于果蔬生產。抗生素進入土壤后易被吸附而長期滯留，危害環境和生態系統，干擾生態系統物質循環和能量流動[3-4]，降低土壤肥力，甚至會被農作物吸收富集[5-6]而危害農產品安全。

四環素類抗生素(TCs)是一種使用非常普遍、價格低廉、副作用小且強有效的人畜共用抗菌藥。據統計，2013年我國抗生素的總產量達248 000 t，消耗總量達162 000 t，其中用于動物的消耗量為84 240 t，用于人類的消耗量為77 760 t[7]。白菜是人們最常食用的蔬菜且被大面積種植，它具有對污染物敏感、易于栽培、生命周期短等特性，常被用作評價生態毒性的受試植物[8-9]。因此，本研究選擇常用的3種四環素類抗生素[四環素(TC)、土霉素(OTC)和金霉素(CTC)]，研究鈣離子(Ca2+)與四環素類抗生素單體、復合溶液以及廣東省廣州市北郊供試土壤解吸液對白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)種子的萌發、根和芽伸長的影響，旨在評價復雜體系四環素類抗生素對生態環境的影響，為其風險評價提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

3種四環素類抗生素：四環素、金霉素和土霉素，均購買于CATO(美國)，純度均>96.2%。CaCl2、次氯酸鈉溶液等試劑購買于廣州化學試劑廠。白菜種子購買于當地市場上的種子公司。

1.2 儀器設備

本試驗所用儀器設備包括培養箱、離心機、高壓滅菌鍋、直徑90 mm的玻璃培養皿、容量瓶(50、100 mL)、10 mL 量筒、10 mL移液管、100 mL燒杯、溫度計、玻璃棒、鑷子、剪刀、刻度尺、保鮮膜、紗布、定性濾紙(90 mm定性濾紙)。

1.3 樣品采集

供試土壤采集于廣東省廣州市北郊區域典型蔬菜基地，均為0～20 cm土層樣品，風干磨細過60目篩，經檢測后篩選

不含3種目標抗生素的土壤樣品。供試土壤地理位置：113°17′46″E、23°29′16″N，理化性質：全氮含量為1.70 g/kg，有機質含量為36.55 g/kg，有效磷含量為21.78 mg/kg，速效鉀含量為 108.91 mg/kg，pH值為7.28，陽離子交換量(CEC)為 9.13 cmol/kg。

1.4 試驗方法

1.4.1 解吸液的獲取 參照OECD guideline 106(2000)批量平衡法對供試土壤進行吸附解吸試驗，準確稱取若干份相同質量的土樣0.500 0 g(精確至0.499 5～0.500 5 g)于100 mL玻璃離心管中，高壓濕法間歇滅菌3次(121 ℃，100 kPa，20 min)，烘箱中于60 ℃烘干；加入過濾法滅菌的CTC、OTC溶液及背景電解質溶液CaCl2，使最終溶液體積為20 mL，CaCl2溶液濃度為0.01 mol/L。系列TC、CTC、OTC濃度均為 1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/L。旋渦混勻，在(25±1) ℃及150 r/min條件下，于恒溫振蕩箱中黑暗條件下振蕩24 h，之后在4 500 r/min條件下離心10 min，去其上清液。然后重新加入0.01 mol/L CaCl2溶液20 mL，繼續振蕩24 h，離心后取其上清液供后續試驗。以上處理均做3個重復，其中不含抗生素的處理作為空白，不含土壤的處理作為對照(CK)。

1.4.2 種子發芽率試驗 4種供試液CaCl2溶液、抗生素溶液、含0.01 mol/L CaCl2抗生素溶液及解吸溶液均用去離子水配制。CaCl2溶液濃度設置為5×10-5、1.0×10-4、2.0×10-4、1.0×10-3、2.5×10-3、1.0×10-2mol/L(0.01 mol/L)，抗生素溶液和含0.01 mol/L CaCl2的抗生素溶液的濃度設置同吸附解吸試驗濃度，以去離子水為對照(CK)。

將白菜種子在0.2%次氯酸鈉溶液中浸泡消毒15 min，然后用去離子水沖洗3～5遍。在40 ℃溫水中浸泡種子 2～3 h直至水冷，重復2次，白菜種子發芽試驗采用保濕培養法，取2層滅菌后的濾紙平鋪在玻璃培養皿(直徑D=90 mm)中，吸取10 mL供試溶液后，將篩選好的種子隨機取20 粒平放在濾紙上，設置3 個重復。在黑暗(可防止抗生素發生光水解)的培養箱內于25 ℃ 培養48 h后，取出并記錄種子的發芽率并測量各處理濃度下種子芽長及根長(芽長：下胚軸基部至芽頂端的長度；根長：下胚軸基部至主根尖端的長度)。

1.4.3 劑量-效應曲線擬合 不同四環素類抗生素對白菜種子根和芽伸長的抑制性的劑量-效應關系曲線借鑒Logistic分布模型，將模型轉化為對數進行擬合：

y=aln(x)+b。

式中：y為抑制長度，cm；x為培養試液的有效濃度，mg/L；a、b為常數。

1.5 數據分析

采用Excel 2010進行數據分析，計算3次重復的平均值及標準偏差，繪制圖形，并用SPSS 17.0對數據進行顯著性分析，差異顯著性水平α=0.05。

2 結果與分析

2.1 Ca2+ 單體溶液對白菜種子發芽率和根、芽伸長的影響

不同濃度Ca2+中白菜種子發芽率在71.67%～88.33%(表1)，方差分析發現，Ca2+濃度對白菜種子發芽率有極顯著影響(P<0.01)，對芽伸長和根伸長具有顯著影響(P<0.05，圖1)。

表1 不同濃度Ca2+溶液處理下白菜種子的發芽率

注：表中數據為平均值±標準差。同列數據后標有不同大寫、小寫字母分別表示在0.01、0.05水平上差異顯著。

由圖1可知，白菜種子發芽后根系長度隨著Ca2+濃度增加呈先增大后逐漸減小的趨勢。與CK(0 mol/L)相比，5×10-5mol/L 濃度條件促進根系增長，可能是由于Ca2+與細胞液進行物質交換，激活了細胞[10]。隨著Ca2+濃度的增加，根系長度相比于CK均出現抑制現象，且1.0×10-2mol/L濃度條件下根系長度約是CK的1/3，抑制了根的伸長。Ca2+濃度對芽生長影響較小，相比于CK，5×10-5～2.0×10-4mol/L CaCl2溶液處理的芽均有明顯伸長，但1.0×10-3～1.0×10-2mol/L CaCl2對芽伸長無明顯影響。根伸長對Ca2+比芽伸長更為敏感。

2.2 3種四環素類抗生素單體溶液對白菜種子發芽率及根和芽伸長的影響

不同濃度梯度下，3種四環素類抗生素單體處理下白菜種子發芽率在61.67%～88.33%，結果見表2。方差分析發現，四環素和土霉素對白菜的發芽率有顯著影響，金霉素對白菜種子發芽率的影響達極顯著水平。

從圖2可知，金霉素、土霉素、四環素對白菜根伸長表現為明顯的抑制作用，且低濃度抗生素溶液對白菜根伸長的抑制強于高濃度。在低濃度抗生素處理下(0～5.0 mg/L)，隨著濃度的提高，根伸長抑制趨勢越明顯。而在抗生素濃度>5.0 mg/L時，根伸長抑制作用隨濃度的提高有所降低。低濃度時，3種四環素類抗生素對根伸長的抑制作用有明顯差異，白菜根伸長對金霉素最為敏感，與空白對照相比，金霉素濃度增至1.0 mg/L，白菜根伸長從1.81 cm縮短至0.93 cm，縮短近50%。而土霉素濃度達到5.0 mg/L時，才對白菜根伸長的抑制最為明顯。 高濃度時，3種四環素類抗生素對根伸長抑制作用無明顯差異。

3種四環素類抗生素對白菜芽伸長抑制作用較小。在0～2.0 mg/L濃度范圍內，四環素和土霉素對芽生長均具有一定的促進作用，其中土霉素的作用效果高于四環素。當濃度高于2.0 mg/L時，3種抗生素對芽伸長的影響開始出現差異，四環素濃度增至 10.0 mg/L 時，對芽長的抑制作用最為明顯，土霉素濃度高于 2.0 mg/L 時，白菜芽生長隨濃度的增加一直在減少；但金霉素對芽伸長在低濃度時稍有抑制作用，在5.0 mg/L時抑制效果最大，之后大約保持該抑制性。

表2 抗生素單體溶液對白菜種子發芽率的影響

注：同行數據后標有不同大寫、小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)、顯著(P<0.05)。表3同。

2.3 CaCl2 溶液配制的抗生素溶液對白菜種子發芽率及根和芽伸長的影響

含0.01 mol/L Ca2+的抗生素各濃度處理結果表明，四環素和土霉素對白菜種子發芽有顯著影響，金霉素對白菜種子發芽無顯著影響。其發芽率在60.00%～81.67%(表3)，略低于只含抗生素單體的溶液。與0.01 mol/L CaCl2溶液相比，各濃度抗生素處理的白菜種子根長和芽長明顯降低(圖3)。Ca2+和抗生素共存時，抗生素濃度由0增至5.0 mg/L，根長大幅度減小，當濃度大于5.0 mg/L，根長變化不明顯。3種抗生素在5.0 mg/L的同濃度處理下，根長相差不大，與只含抗生素單體溶液的結果相似。0～5.0 mg/L濃度范圍內，3種抗生素與CaCl2復合溶液對根伸長的影響順序為金霉素>四環素>土霉素。當濃度低于2.0 mg/L時，四環素處理下芽生長呈明顯的下降趨勢；而土霉素和金霉素處理的芽長在0～1.0 mg/L 范圍內大幅度下降，在1.0～2.0 mg/L濃度下呈微增長趨勢，但依舊低于不含抗生素處理(0 mg/L)的芽長。

表3 CaCl2和抗生素復合溶液處理對白菜種子發芽率的影響

2.4 含Ca2+的抗生素復合溶液和只含抗生素單體溶液處理的比較分析

0.01 mol/L CaCl2溶液配制的抗生素各處理濃度對根和芽伸長的抑制大于用去離子水配制的抗生素各標液，方差分析表明，2種配制方法中3種抗生素均出現處理間的顯著差異(P<0.05)，且各濃度處理下，只含抗生素單體溶液處理的種子根和芽的長度約是含Ca2+和抗生素復合溶液處理的2倍。因此，Ca2+和3種四環素類抗生素的復合溶液對白菜根和芽伸長抑制明顯大于只含抗生素單體溶液。另外，解吸液試驗結果顯示，除不含土壤的空白對照組種子發芽[發芽率在(50±5)%]外，其余試驗組種子均未發芽。一方面是白菜種子對污染物極為敏感，另一方面可能是供試土壤中大量陽離子(9.13 cmol/kg)和金屬離子隨著解吸過程進入解吸溶液，并與抗生素形成毒性更大的螯合物[11-12]。

2.5 Ca2+和3種四環素類抗生素單體溶液及其復合溶液對白菜種子根長和芽長的生態毒理效應

植物的半抑制濃度常用于評價污染物的毒性強弱。由表4可見，水溶液中含Ca2+和抗生素對白菜根長和芽長抑制作用最強，根長IC50均小于0.1 mg/L，芽長IC50小于12 mg/L，說明白菜種子的根長是含Ca2+和抗生素類有機污染生態毒理學的敏感生態學指標[13]，且對根長和芽長的毒性大小為Ca2+和抗生素的復合溶液>3種抗生素單體溶液>Ca2+溶液，并且根長>芽長。這可能是由于植物對抗生素的吸收大部分在根部[14]，只有少部分轉移到其他部分并積蓄[15]。而且金屬離子與有機污染的復合毒性大于單一污染物的毒性。從而使白菜種子在較低含量的復合污染脅迫下，根部首先受到影響被抑制時，芽吸收種子自身養分而不被抑制。當然，隨著抗生素和Ca2+的單體及復合溶液濃度增加，污染物會被根部吸收，甚至通過胚進而影響芽伸長和植株的生長[16]。這與林琳等的研究結果[8，15，17]相似。在同等條件下，Ca2+和抗生素的復合溶液對白菜種子根長和芽長抑制效應最大，其次是3種四環素類抗生素的單體，Ca2+的抑制效應最小，且均為根長的抑制效應大于芽長。

表4 Ca2+和3種四環素類抗生素的單體及復合溶液對白菜種子根長和芽長的半抑制濃度

3 結論

Ca2+對白菜種子萌發有顯著影響，且對白菜種子根伸長有明顯的抑制性，但對芽伸長的影響不明顯。金霉素單體溶液對白菜種子萌發有極顯著影響，其次為四環素和土霉素。Ca2+和四環素的復合溶液、Ca2+和土霉素的復合溶液對白菜種子發芽率有顯著影響，而Ca2+和金霉素的復合溶液無顯著影響。

在本試驗濃度范圍內，3種四環素類抗生素單體對白菜根伸長具有明顯的抑制趨勢。當濃度低于5.0 mg/L時，對根伸長抑制效應大小排序為金霉素>四環素>土霉素；當低于 2.0 mg/L 時，對芽伸長有促進作用，其中土霉素對芽長的影響最大。

Ca2+和3種四環素類抗生素的復合溶液對白菜根和芽伸長的抑制效應明顯大于抗生素單體溶液。對根長和芽長的毒性大小排序為Ca2+和抗生素的復合溶液>3種抗生素單體溶液> Ca2+溶液，并且對根長的影響大于芽長。