基于DNA條形碼的翠云草快速鑒定方法研究＊

覃 桂，聶 晶，張 飛，胡炳雄，肖 凌，汪 波

（湖北省藥品監督檢驗研究院 武漢 430075）

翠云草（Selaginella uncinata）系蕨類卷柏科卷柏屬植物，該屬植物在全世界有700余種，在我國分布較為廣泛，約有60～70種[1]，其中22種有藥用記載，在湖北分布的藥用種類達14種，以全草入藥，具有清熱、解毒、降糖、鎮痛等多種功效[2,3]，得到廣泛關注和大量的研究，卷柏（S.tamariscina）和墊狀卷柏（S.pulvinata）作為卷柏藥材基源收載入《中國藥典》。

作為民間廣泛使用的中草藥品種，翠云草早在《神農本草經》中就有記載，具有清熱利濕、止咳止血、抗菌消炎等功效[4]，現代藥理研究表明其還具有抗炎、抗腫瘤、免疫調節等藥理作用[5,6]，應用于黃疸、腸炎、腎炎水腫、肺結核咳血、風濕性關節炎、外傷出血等癥的治療，具有較高的藥用價值。然而，卷柏屬植物紛繁多樣、分類復雜[7,8]，不同種植物間的鑒別性狀存在交叉重疊[9,10]，且調查發現不同生境或不同采收期樣本的性狀存在明顯差異，給翠云草的準確鑒定帶來很大困難，給正確用藥造成障礙。因此，建立快速準確鑒定翠云草的方法對該重要藥用植物的開發及應用至關重要。

本研究基于卷柏屬藥用植物DNA條形碼鑒定序列種間變異位點信息，針對翠云草設計特異引物及TaqMan探針，通過實時熒光定量PCR檢測法對目的片段進行擴增，比較翠云草及其同屬植物特異片段擴增的熒光信號差異，區分翠云草及其近源物種，為翠云草的快速鑒定提供檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用材料分別收集自湖北、湖南、廣西等地（表1），共涉及卷柏屬11種32批，所有樣本均經由中南民族大學藥學院萬定榮教授鑒定。對所收集的樣本以75%乙醇擦拭清潔表面后分別編號，硅膠干燥后保存于湖北省藥品監督檢驗研究院中藥檢驗所。其余34物種的103條ITS2序列均來源于Genbank數據庫（表2）。

表1 實驗樣品信息表

1.2 樣品DNA提取、PCR擴增與測序

1.2.1 DNA提取

取干燥組織約30 mg，用高通量組織研磨儀（Scientz-48，China）研磨120 s（50 Hz）至呈粉末狀，使用植物DNA提取試劑盒（TIANGEN Biotech（Beijing）Co.,Ltd DP305-02）提取總DNA，并對該試劑盒抽提及沉淀DNA的方式作如下改進：65℃水浴10 min改為水浴過夜，使用氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提2次，使用預冷的異丙醇放入-20℃冰箱沉淀DNA。

1.2.2 PCR擴增

PCR擴增反應體系及擴增程序等參考中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則（《中華人民共和國藥典》2015年版通則9107），上游引物2F：CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCA；下游引物3R：CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCC ACCPCR，擴增產物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，對條帶單一且清晰的PCR產物純化后使用ABI3730XL（Applied Biosystems Co.,USA）測序儀進行雙向測序。

1.2.3 序列拼接和數據分析

測序峰圖釆用序列拼接軟件CodonCode Aligner V3.71（CodonCode，Dedham，MA，USA）校對拼接，去除低質量序列及引物區。采用基于隱馬爾可夫模型的HMM注釋方法去除兩端5.8S和28S區段即可獲得ITS2間隔區序列[12]。然后，將所有序列用軟件MEGA5.0（molecular evolutionary genetics analysis）分析比對[13]，用鄰接（NJ）法構建系統聚類樹，各分支支持率通過Bootstrap（1000次重復）進行檢驗。

1.3 TaqMan探針法鑒定翠云草藥材

1.3.1 引物、探針的設計及合成

根據實驗獲得的11物種32條序列及GenBank數據庫中下載的34物種103條序列的序列特征，針對翠云草種內保守及種間高變異區域，使用引物設計軟件Primer Express v3.0和primer3（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設計篩選得到一組特異引物和TaqMan探針，預期擴增片段長度為101 bp，引物及探針委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。探針5′端用FAM標記，3′端用TAMRA標記，引物和探針序列見表3。

1.3.2 熒光PCR反應及評價驗證

基于TaqMan探針的熒光定量PCR反應是在ABI stepone plus實時熒光定量PCR儀上完成，按照Goldstar TaqMan Mixture（CWBIO，CW2625）提供的標準操作流程操作，25μL反應體系：2×GoldStar TaqMan Mixture 12.5μL，引物CYC-R 1μL，引物CYC-F 1μL，探針 CYC-P 1 μL，50×High ROX 1 μL，模板 1 μL，ddH2O 7.5 μL；熒光定量PCR擴增程序：95°C預變性10 min；95°C變性15 s，60°C退火60 s，72°C延伸45 s，30個循環；72°C延伸10 min，收集熒光信號。以翠云草DNA為陽性樣品，以除翠云草外的卷柏屬其他樣本DNA為陰性樣品，進行熒光PCR反應檢測以確定該方法的特異性；以從不同翠云草樣品中提取的DNA為模板，應用熒光PCR檢測法進行組內試驗與組間試驗，每個樣本做3次平行檢測，以確定本方法的可重復性；分別稱取1 mg、2 mg、4 mg、10 mg和30 mg的翠云草樣品提取DNA，以其為模板進行熒光PCR反應，探討該方法靈敏度。

表2 GenBank數據庫獲得卷柏屬植物ITS2序列登錄號信息

2 結果與分析

2.1 種間ITS2序列聚類分析

基于本實驗所得卷柏屬序列及Genbank上已發表序列，以鄰接（NJ）法構建系統聚類樹（圖1）。聚類分析表明：翠云草能單獨成支，紅枝卷柏、伏地卷柏、疏松卷柏、鐮葉卷柏、中華卷柏、深綠卷柏、疏葉卷柏也分別與其余物種有明顯分界，而異穗卷柏與劍葉卷柏、江南卷柏與兗州卷柏、卷柏與墊狀卷柏之間遺傳關系較近，并未呈現較好單系性。本實驗采集的樣品中，同一產地或產地相近（江南卷柏6、7、12、14、15、10、13號樣品）的樣品先分別聚類，再與產地較遠的其余樣品（江南卷柏8、9號樣品）聚類，說明江南卷柏產地相距越遠，遺傳差異越明顯。該實驗結果表明，ITS2序列能較好的用于翠云草的聚類分析及鑒定，也能較明顯的揭示卷柏屬植物間遺傳差異，為卷柏屬藥用植物資源分類鑒定提供了新途徑。

表3 引物與探針序列

2.2 翠云草實時熒光定量PCR快速檢測

2.2.1 特異性驗證結果

通過RT-PCR儀擴增，自動檢測熒光信號強度曲線得到特異性驗證結果見圖2（A），翠云草樣本熒光信號隨著擴增循環數的增加逐步增強，上升趨勢明顯，信號強度與始終無明顯信號強度的陰性樣本差異顯著（ΔRn值均相差1.0以上），該結果表明該方法能準確反映目標產物的擴增，引物具有良好的特異性。

2.2.2 重復性驗證結果

取兩批翠云草樣本分2組，每組內同一樣本做3次平行試驗，得到相應擴增曲線見圖2（B），組間不同翠云草樣本及同組內相同翠云草樣本的平行實驗結果表明：30個循環后，翠云草樣本ΔRn值均大于1.0，每份樣本PCR產物量基本一致，曲線整體走勢基本相同，該結果表明該方法具有良好重復性。

2.2.3 靈敏性驗證結果。

圖1 卷柏屬131條序列聚類分析進化樹

圖2 特異性、重復性、靈敏性驗證結果圖

分別以5種不同取樣量的翠云草樣本DNA為模板，進行RT-PCR靈敏度分析見圖2（C）。結果顯示，當取樣量在1 mg以上時，用建立的RT-PCR方法檢測能產生較好的特異性擴增，陰性對照無明顯特異性擴增，表明該方法具有較好靈敏性，可從低至1 mg的樣品中提取DNA并得到有效檢出。

3 討論

3.1 ITS2序列在卷柏屬藥用植物翠云草鑒定中的作用

傳統中藥材鑒別主要集中于形態、顯微及理化鑒別，隨著分子生物學技術的日益成熟，DNA條形碼鑒定技術因技術簡便、鑒定準確、使用方便等特點已被廣泛應用于中藥鑒定[13,14、15]，以ITS2/ITS為主體鑒定序列的植物類中藥材鑒定體系已收錄入2015年版《中華人民共和國藥典》，該序列對卷柏屬植物也具有較高的鑒定效率[16]。在本研究在構建的系統進化樹中，翠云草單獨成支，可與其它物種很好區分，表明該序列對翠云草具有較高的鑒定能力，雖然江南卷柏、兗州卷柏、薄葉卷柏、墊狀卷柏及藤卷柏未能單獨聚為一支，但并不影響翠云草的鑒定。

3.2 熒光PCR在翠云草快速檢測中的應用

實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，能反應樣品中靶DNA含量多少及動態變化，現亦被廣泛應用于物種鑒定[17,18]，本研究基于實時熒光定量PCR檢測技術，建立了翠云草快速鑒定新方法，并從特異性、重復性及靈敏性三方面進行了方法學驗證。結果表明，通過直觀信號圖可將翠云草與常見同屬近源物種樣本有效區分，準確度高、耗時短，體現了該方法快速、高效、準確的鑒定特點。相較于形態學、顯微結構特征、化學指紋圖譜等的傳統鑒定方法[19,20]，該方法特異性更強、污染小、自動化程度高、操作簡便，并通過熒光信號強度的差異客觀反應鑒定結果，實現了翠云草與其它近緣物種準確、高效的鑒定，彌補了傳統鑒定方法的不足，為翠云草的快速、準確鑒定提供了新的技術途徑，為保障翠云草臨床用藥的有效性提供了技術支持。