黃芪破壁飲片的DNA條形碼鑒別與黃酮類成分HPLC指紋圖譜研究＊

王 艷，彭麗華，鄭夏生，成金樂＊＊

（1.廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點實驗室（廣州中醫藥大學），國家中成藥工程技術研究中心南藥研發實驗室 廣州 510006；2.國家中醫藥管理局中藥破壁飲片技術與應用重點研究室，中山市中智藥業集團有限公司 中山 528437；3.廣州中醫藥大學 廣州 510006）

《中國藥典》2015年版收載的藥用黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1]。具補氣固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌的作用[2]。其主要有效成分為黃酮類、皂苷類、多糖類等。

中藥破壁飲片是通過現代粉碎技術將傳統中藥飲片加工至D90＜45 μm（300目以上）的破壁粉體，進而通過無添加成型技術制成的30～100目的干燥顆粒狀飲片[3]。中藥破壁飲片與傳統飲片相比，具有全成分入藥、均勻性好、利用率高、服用簡單、便攜的特點，經過細胞破壁后破壁草本的有效物質溶出率更高[4]，臨床上也得到越來越多人的關注。但同時，破壁之后失去了絕大多數藥材的原有性狀特征，增加了其物種鑒定的難度，DNA條形碼技術從基因水平對物種進行鑒定，為中藥破壁飲片真偽鑒定提供有效手段。此外，研究表明，黃芪中黃酮類成分具有清除氧自由基，抑制脂質過氧化和維持血中一氧化氮濃度，保護缺血再灌注損傷的作用[5]。有文獻報道[6]，通過黃芪提取物抗疲勞作用的比較，得出黃芪中黃酮類成分的藥效最佳。同時通過不同產地黃芪總黃酮HPLC指紋圖譜研究[7]表明不同產地之間黃芪的質量存在很大的差異。本實驗采用了DNA條形碼技術，選用ITS2為主體序列，psb A-trn H為輔助序列[8]對產地為甘肅的黃芪藥材制成的黃芪破壁飲片進行了物種鑒定，同時建立了2015版藥典中蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao破壁飲片黃酮類成分HPLC指紋圖譜，為黃芪破壁飲片的質量控制提供了有效的方法。本文通過DNA條形碼、HPLC指紋圖譜兩種方法相結合，在真偽鑒別的前提下，對15批黃芪破壁飲片進行質量分析，再通過指紋圖譜相似度比較，對黃芪破壁飲片的真偽與批間一致性進行綜合評價。

1 材料與儀器

1.1 藥物及試劑

1.1.1 受試藥物

15批黃芪原藥材購自甘肅岷縣順興和中藥材有限公司，均由中山市中智藥業集團有限公司制備成15批黃芪破壁飲片，批號：20170601(S1)、20170602(S2)、20170701(S3)、20170702(S4)、20170703(S5)、20170704(S6)、20170705(S7)、20170706(S8)、20170707(S9)、20170708(S10)、20170709(S11)、20170801(S12)、20170802(S13)、20170803(S14)、20170804(S15)。

1.1.2 對照品

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（中國食品藥品檢定研究院）、芒柄花素（中國食品藥品檢定研究院）、毛蕊異黃酮（成都曼斯特生物科技有限公司）、刺芒柄花苷（成都曼斯特生物科技有限公司）。

1.1.3 試劑

甲醇（OCEANPAK）、乙腈（Merck KGaA）為色譜純；水為超純水；其他試劑為分析純。植物基因組DNA提取試劑盒（百泰克，DP3111）；2×Power Taq PCR Master Mix（百泰克，PR1701）

1.2 儀器

生物樣品均質儀（愛施德，Bioprep-24）、低溫冰箱（Eppendorf，5430R）；多功能 PCR 儀（Biometra，Flex Cycler 2）；水平電泳儀（Bio-Rad）；凝膠成像儀（Biometra，BDA digital）。高效液相色譜儀（Thermo Fisher，U3000）；明澈TM-D24UV純水系統；KQ-400KOE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋DK-S24（上海森信實驗儀器有限公司）；萬分之一電子天平AB204-S（METTLER TOLEOD）、十萬分之一電子天平AUW220D（島津公司）。

2 實驗方法

2.1 DNA條形碼方法

2.1.1 樣品前處理

分別稱取各樣品50 mg，置于陶瓷研缽中，用力研磨，取粉末用于DNA提取。

2.1.2 DNA提取

試劑盒法：按照新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（百泰克，DP3111）說明書操作。

2.1.3 PCR擴增和測序[9]

PCR反應體系：2×Power Taq PCR Master Mix（百泰克，PR1701）12.5 μL，正反向引物：ITS2-2F，ATGCGATACTTGGTGTGAAT；ITS2-3R，GACGCTT-CTCCAGACTACAAT；psbA-trnH 引物：psbA-F，GTTATGCATGAACGTAATGCTC；trnH-R，CGCGCATGGTGGATTCACAATCC各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補足體積至25.0μL；陰性對照（Negativecontrol，NC）采用ddH2O作為模板。溫度程序（ITS2）：94℃，4 min；94℃，30 s，52 ℃，30 s，72 ℃，45 s，35個循環；72 ℃，5 min。溫度程序（psbA-trnH）：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s，52 ℃，20 s，72℃，50 s，35個循環；72℃，5 min。反應完成后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測各PCR產物，在目的區域出現清晰條帶的樣品則送檢做Sanger測序。

2.1.4 數據處理

將測序所得的原始峰圖導入CodonCodeAligner（Version5.1.5.0）進行序列處理，去除5.8SrRNA和28SrRNA區以獲得ITS2序列；psbA-trnH片段則僅進行引物區域裁切。將各樣品的ITS2序列和psbA-trnH序列作為Quary分別在NCBI、中藥材DNA條形碼鑒定系統（http：//www.tcmbarcode.cn/china/index.php?optionid=174）上做比對，取同源性最高的比對結果。

2.2 指紋圖譜方法

2.2.1 提取溶劑的考察

取黃芪破壁飲片（批號：20170705）3 g，精密稱定，精密加入甲醇、乙醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇20 mL，靜置30 min，超聲40 min，搖勻，過濾，續濾液再經過0.22 μm微孔濾膜濾過，進樣10 μL，結果表明，用甲醇提取所測得的各主要峰峰面積之和最大，因此，選擇純甲醇作為黃芪破壁飲片的提取溶劑。

2.2.2 提取方法的考察

取黃芪破壁飲片（批號：20170705）3 g，精密稱定，精密加入甲醇20 mL，靜置30 min，比較回流提取、超聲提取等提取方法的提取效果結果表明，回流提取和超聲提取方法的提取效果相差不大，但考慮到實驗操作的簡便性，故選取了超聲提取。

2.2.3 供試品溶液的制備

取黃芪破壁飲片3 g，精密稱定，加甲醇20 mL，靜置30 min，超聲40 min，搖勻，過濾，續濾液再經過0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.4 檢測條件的確定

2.2.4.1 檢測波長的選擇

用十八烷基硅膠為填充劑，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（B）-0.15%甲酸水溶液（A），按照程序梯度洗脫：0-10 min，5%-30%(B)；10-30 min，30%(B)；30 min-50min，30%-60%(B)；50min-52min，60%-5%(B)；52min-60 min，5%(B)；柱溫：25℃；體積流量：0.6mg?ml-1；進樣量：10 μL。在選擇檢測波長過程中，采用全波長掃描，圖譜顯示在254 nm處樣品出峰數多，各主要峰面積面積之和較大，故選254 nm作為檢測波長。

2.2.4.2 流動相的確定

用十八烷基硅膠為填充劑，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為①甲醇-水②乙腈-水③乙腈-0.1%甲酸水溶液④乙腈-0.15%甲酸水溶液⑤乙腈-0.2%甲酸水溶液⑥乙腈-0.1%磷酸水溶液⑦乙腈-0.1%乙酸水溶液梯度洗脫。柱溫：25℃；體積流量：0.6mg?ml-1；進樣量：10 μL。比較各流動相下圖譜的分離度和半峰寬，結果選取④號系統為流動相。

2.2.5 方法學考察

2.2.5.1 精密度試驗

取同一黃芪破壁飲片供試品（批號：20170705），照上述色譜條件與系統適應性試驗項下方法，連續進樣6次，各圖譜的相似度均在0.99以上，表明儀器等整個檢測系統的精密度良好。

2.2.5.2 穩定性試驗

取黃芪破壁飲片供試品溶液（批號：20170705），分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h測定，各圖譜相似度均在0.99以上，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.5.3 重復性試驗

取黃芪破壁飲片（批號：20170705）3 g，共6份，分別依法制成供試品溶液，照上述色譜條件與系統適應性試驗項下方法，分別進樣，各圖譜相似度均在0.99以上，表明該方法的重現性良好。

圖1 15個樣品ITS2擴增結果

圖2 15個樣品psbA-trnH擴增結果

3 實驗結果

3.1 DNA條形碼實驗結果及分析

3.1.1 ITS2片段及psbA-trnH片段擴增結果

15批黃芪破壁飲片均能成功提取出基因組DNA，并可成功獲得ITS2片段及psbA-trnH片段（見圖1、2）

3.1.2 ITS2鑒定結果

利用ITS2片段可以成功鑒定出本研究中的15批黃芪破壁飲片，其各批次之間的堿基均一致，各樣品的ITS2序列比對結果與公共數據庫中蒙古黃芪已有序列的同源性達到100%（見表1），ITS2序列比對過程中未出現除蒙古黃芪同源性達到100%的其他物種。

3.1.3 psbA-trnH鑒定結果

比對結果表明，各批次樣品之間的序列一致，各樣品中的psbA-trnH序列比對結果與公共數據庫中蒙古黃芪已有序列的同源性均達到100%（見表2），psbA-trnH序列比對過程中未出現除蒙古黃芪同源性達到100%的其他物種。

3.1.4 結果分析

ITS2及psbA-trnH鑒定結果顯示，實驗所用的黃芪為蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao。

表1 ITS2序列比對結果

表2 psbA-trnH序列比對結果

3.2 HPLC指紋圖譜實驗結果及分析

3.2.1 指紋圖譜的建立

取15批黃芪破壁飲片供試品溶液各10 μL，在上述色譜條件下進行測定，得到15批不同批次黃芪破壁飲片HPLC指紋圖譜，根據色譜圖中各色譜峰的相對保留時間，確定共有峰，并選取其中11個共有峰作為特征指紋峰，建立的指紋圖譜見圖3（S1～S15分別對應上述樣品批次名稱）。

3.2.2 共有峰的標定

圖3 15批不同批次黃芪破壁飲片HPLC指紋圖譜及對照圖

根據15批黃芪破壁飲片的指紋圖譜檢測結果，選擇圖譜中峰面積較大、峰形較好的色譜峰為共有峰，在對照圖譜上共標定11個共有峰。經過與對照品比對知5號峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，7號峰為刺芒柄花苷，10號峰為毛蕊異黃酮，11號峰為芒柄花素，見圖4。計算各色譜峰保留時間和保留峰面積與同一圖譜中S峰的保留時間和保留峰面積比值，得到的相對保留時間和相對峰面積見表4及表5。

3.2.3 共有峰相關信息

色譜圖中5號色譜峰（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）分離度良好，保留時間適宜，故選此峰為參照峰。根據15批黃芪破壁飲片樣品的色譜圖結果，以參照峰峰面積為基準，計算各保留時間與參照峰的保留時間，各共有峰與參照峰峰面積的比值，RSD值在0.024%-0.116%之間，相對保留時間穩定，符合《中藥注射劑指紋圖譜的技術要求（暫行規定）》的要求（結果見表3，表4）。

3.2.4 15批黃芪破壁飲片指紋圖譜相似度評價

對15批不同批次黃芪破壁飲片的HPLC數據進行處理，與對照指紋圖譜相匹配，15批不同批次黃芪破壁飲片的HPLC譜圖的相似度在0.9-1.0之間。表明各批樣品來源均一，質量穩定（表3，表4）。

4 討論

對于已失去外觀形狀的黃芪破壁飲片，本研究通過DNA條形碼技術對實驗所用的15批樣品進行物種鑒定，結果顯示樣品均為2015年版藥典中的蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao。以單一的有效成分控制中藥質量已不能適應中藥現代化的形勢，中藥指紋圖譜可以在不清楚全體化學成分的情況下，有效控制中藥的內在質量，提高中藥質量的穩定性[10]。因此本研究在基源確定后對15批黃芪破壁飲片黃酮類成分進行指紋圖譜研究，方法學考察結果符合指紋圖譜技術要求，并對圖譜進行相似度評價，結果各批次的相似度均大于0.9，表明所用的樣品質量穩定，來源均一。

中藥破壁飲片是一類創新型飲片，目前對黃芪破壁飲片質量評價的方法鮮有報道。藥材的打破細胞壁后失去原有的顯微及外觀特征；但卻具有節省藥材、免煎高效等優點。近年來，越來越多的藥理藥效學研究結果表明中藥破壁飲片相對于傳統飲片具有更好的安全性和有效性[11-14]。本文的研究則是從質量控制方面做出了有意義的探究—利用DNA條形碼技術進行黃芪破壁飲片的物種鑒定，再在物種鑒定的基礎上通過HPLC指紋圖譜技術評價黃芪破壁飲片的質量。辛天怡等[15]提到DNA容易降解，在進行DNA條形碼鑒定過程中，可能會由于DNA降解過于嚴重而無法成功獲得其條形碼序列，采用DNA條形碼技術和與其他方法結合進行檢驗，綜合評價藥品質量更具有說服力。本實驗采用DNA條形碼技術結合HPLC指紋圖譜技術同時評價黃芪破壁飲片的質量，對于生產實踐具有重要的指導意義，同時保證產業化的產品質量，為保證產品批間一致性提供了可行性的方法。

圖4 黃芪破壁飲片指紋圖譜與混合對照品HPLC圖

2015年版藥典中黃芪藥材有2種來源，即蒙古黃芪、膜莢黃芪。這2種來源的黃芪質量具有一定的差異，本實驗只對來源為蒙古黃芪藥材所制成的黃芪破壁飲片進行了HPLC指紋圖譜的研究，對2種來源黃芪質量上的差異進行系列的研究具有一定的必要性。同時本實驗中只收集了甘肅一個產地的不同批次的黃芪藥材制成的黃芪破壁飲片進行研究，實驗結果顯示其質量穩定，對于企業生產上質量控制具有很好的指導意義，但收集蒙古及不同產地的黃芪對比其質量的差異性，為其生產上選擇優質的原藥材更具實際意義。除此之外也需要在指紋圖譜的基礎上對其藥效學進行深入研究，為臨床用藥提供科學的依據。

表3 15批黃芪破壁飲片指紋圖譜共有峰相對保留時間

表4 15批黃芪破壁飲片指紋圖譜共有峰相對峰面積

表5 相似度計算數據-平均數

表6 相似度計算數據-中位數