二仙湯含藥血清通過AKT途徑介導順鉑所致卵巢顆粒細胞凋亡的作用機制＊

楊 蕾，王燕霞，趙丕文，孫麗萍，饒晨晨，楊 陽，張紅紅，陶仕英＊＊

（1.北京中醫藥大學東方醫院 北京 100078；2.北京中醫藥大學中醫學院 北京 100029；3.北京中醫藥大學東直門醫院 北京 100050；4.北京中醫藥大學生命科學院北京 100029；5.順義中醫醫院 北京 101300）

卵巢顆粒細胞（Ovarian granulosa cell，OG）是位于卵泡表面的多層壁細胞，顆粒細胞一方面能夠參與運輸營養物質供給卵母細胞，另一方面可以與卵泡內膜細胞共同作用，分泌激素、生長因子等多種物質，調控卵母細胞的發育。卵巢功能下降會導致卵泡數目減少、卵子質量下降[1]。卵巢儲備功能發生異常直接影響女性的生育能力，可引發不孕[2]。

順鉑（Cisplatin,CDDP）是目前臨床廣泛應用于的化療藥物，作為細胞毒性藥物殺死腫瘤細胞。順鉑在殺傷腫瘤細胞的同時，可以破壞正常的卵巢顆粒細胞，產生嚴重的細胞毒性作用[3]。由順鉑引起的卵巢功能破壞已經成為臨床常見且難治愈性婦科疾病，且發病率在近幾年呈現出上升趨勢[4]。西醫治療主要是以雌、孕激素周期序貫療法為主，改善相關癥狀。傳統醫學則認為卵巢功能發生異常主要是腎氣虧虛，精血不足所致，治當以填精益髓，調理陰陽，補益天癸[5]。二仙湯是張伯訥教授研制出來治療為絕經期綜合癥的方子，主要具有溫腎益精、調理沖任、滋陰降火、平調陰陽的作用[6]。在臨床治療卵巢功能異常中具有明顯的療效。

近年來，隨著研究的不斷深入，本課題組前期也做了相關的實驗研究。本課題組前期通過動物實驗發現二仙湯具有調整生殖/內分泌，保護卵巢的作用[7]。但是對其作用途徑和機理缺乏深入分析和探討。因此，本實驗將探討二仙湯含藥血清通過AKT途徑介導順鉑所致卵巢顆粒細胞凋亡的保護機制，以期為臨床應用提供理論依據。

1 材料

1.1 實驗用藥

二仙湯方劑組成包括：仙靈脾、巴戟天、當歸、黃柏、仙茅、知母。按照《婦科臨床方劑學》規定的劑量比（9∶6∶10∶15∶12∶10）稱取，由北京中醫藥大學東直門醫院提供，根據東直門院提供的中藥顆粒與中藥飲片的固有比例進行計算，最終按照人用藥劑量計算大鼠用藥劑量[7]為7.5*kg-1*d-1。注射用順鉑，每10 mg/支（齊魯制藥有限公司，批號：611048CF）、戊酸雌二醇片1 mg/片（拜耳醫藥有限公司，批號：195A5），均購自東直門醫院。用法與劑量：成人每日1 mg，折算成大鼠所需劑量即0.009 mg·kg-1。

1.2 主要試劑

DMEM-F12培養基、0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司產品，批號1300510、1403413）、孕馬血清促性腺激素（北京歐北有限公司，批號：hor-272）；特級胎牛血清（杭州四季青公司，批號：20160627）；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA細胞裂解液、30%丙烯酰胺-雙丙烯酰胺溶液、濃縮膠緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20160627、20160321、s1051、s1053），ECL超敏發光液（北京普利萊基因有限公司，批號：P1010），蛋白相對分子質量Marker（美國Thermo公司，批號：00246538）；二抗Anti-RabbitIgG/HRP和Anti-MouseI-gG/HRP（北京普利萊基因技術有限公司，批號：c1306c1340）；反轉錄試劑盒：M-MLV First Strand RT Kit、PCR酶：qPCR Master Mix（北京華英生物科技有限公司，目錄號：RT03、Catalog：DBI-2043）；P-AKT、AKT抗體（美國Santa Cruz公司，批號：sc30066sc20341），引物序列（表1）。

1.3 實驗動物

22-24 d健康雌性，SPF級，SD大鼠，共40只，體質量（60±10）g。購自（北京）斯貝福實驗動物科技有限公司，使用許可證：SCXK（京）2011-0004。

1.3 儀器

CO2培養箱（MCO-20AIC,SANYO）；

倒置顯微鏡（TS100,NIKON）；

低溫離心機（3K15,SIGMA）；

表1 引物序列

多功能熒光酶標儀（SAFIRE2,TECAN）；

超凈工作臺（022-2522，此京亞泰隆實驗技術中心）；

鼓風干燥箱（101FXB-2，上海樹立儀器儀表有限公司）；

壓力蒸汽消毒器（YX-280d,江陰濱江醫療設備有限公司）；

離心機（北京京立離心機有限公司LG16-WA型）；

PCR擴增儀（Long Gene公司MyGene MG96+型）；

2 方法

2.1 原代大鼠卵巢顆粒細胞提取及培養

22-24天雌性SD大鼠10只，體重35 g，飼養在23-25℃，光照12 h，食水隨意，適應性喂養一天，注射孕馬血清促性腺激素50IU/只，48小時后，在無菌條件下取出雙側卵巢顆粒細胞進行培養。具體操作如下：

1）取SD大鼠，10%水合氯醛麻醉后，經脫臼處死，浸泡75%酒精中消毒3分鐘；2）消毒后放入已消毒托盤中在超凈臺中取雙側卵巢，放入預冷的Hank′s液2.7 ml；3）用Hank′s液清洗三次，將其中的脂肪、包膜等清理干凈；4）將卵巢移入無血清培養基中，用1 ml一次性注射器刺破卵巢，5 min/只，使顆粒細胞充分釋放；5）加入0.3 ml 2.5%胰酶反復用吸管吹打懸液數次，使顆粒細胞團塊分離。37%消化10 min（每3 min，震蕩或吹打一次）；6）加入1 ml含血清培養液終止消化，并靜置10 min。取懸液加入15 ml離心管中；7）1 000 rpm離心10 min，棄上清。加入生理鹽水5 ml沖散細胞再次離心；8）棄上清，加入10%胎牛血清0.2 ml，吹打均勻；9）計數：應用血球小板計數，調整懸液濃度，以5*105接種于96孔板中。在37℃，5%CO2培養箱中培養。觀察貼壁情況，待細胞長滿瓶底至75%-80%融合時，用于實驗。

2.2 制備藥理血清

22-24天的雌性SD大鼠50只，體重35 g-40 g，飼養在23-25℃，光照12 h，食水隨意，適應性喂養一天，第二天取藥理血清。具體操作如下：

表2 反轉錄反應條件

藥理血清動物分三組：（1）正常組：灌胃蒸餾水0.4 ml/天（2）陽性對照組：灌胃補佳樂0.5 ml/天（3）二仙湯組：灌胃二仙湯0.4 ml/天，各組連續灌胃三天，于第四天晨起七點灌胃，兩個小時以后，心臟取血并分離血清，-20℃保存。

2.3 順鉑干預卵巢顆粒細胞

待細胞生長至底壁的75%-80%時，將模型組、陽性對照組、二仙湯組的培養基吸出，每孔加入CDDP（濃度為2.5 ug/ml）200 ul，放入37℃，5%CO2的培養箱中培養12 h。

2.4 藥理血清處理

于CDDP作用12 h后，進行給藥處理，每孔加入相應的藥理血清組200 ul，放入37℃，5%CO2的培養箱中培養24 h，進行指標測定。

2.5 TUNEL法檢測大鼠卵巢顆粒細胞的凋亡情況

1）收集細胞，胰酶消化然后離心，去上清液，留沉淀；2）加入4%多聚甲醛固定放在4℃冰箱保存2 d；玻片加入稀釋好的TdT和DIG-d-UTP，混勻；4）吸走切片上多余液體后將所有樣品統一放入濕盒中，37℃、2 h、0.01M TBS洗2 min，清洗3次；5）每片滴加封閉液50 μl，放置室溫下30 min，然后甩掉封閉液；6）用抗體稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體：混勻后滴加50 μl；7）將樣品放置于濕盒中，37℃反應30 min。0.01 M TBS洗2 min，清洗3次；8）用抗體稀釋液1：100稀釋SABC：取1 ml抗體稀釋液加SABC 10μl，混勻后分別滴加50μl至每個標本切片上；9）37℃反應30 min；10）0.01 M TBS洗5 min，清洗4次；11）加SABC-FITC的標本在熒光顯微鏡下調用藍色光激發并觀察、記錄；

2.6 蛋白印跡法（Western Blot）檢測各組顆粒細胞中akt、p-akt蛋白表達量

1）蛋白提取；2）蛋白質定量；3）SDS－PAGE電泳：配10%分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。SDS-PAGE電泳（濃縮膠80 V，分離膠120 V），電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉膜；4）電轉膜儀轉膜：采用濕轉法進行電轉移，60 V，120 min；5）封閉：室溫下在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中于搖床上輕輕搖動封閉1.5 h；6）一抗孵育：加一抗4℃過夜，用TBST在室溫下搖床上洗三次，每次10 min。7）二抗孵育：加二抗室溫孵育1 h，用TBST在室溫下搖床上洗三次，每次10 min。8）蛋白檢測：顯色加HRP-ECL超敏發光劑作用2-5 min，置于保鮮膜內固定于暗盒中、。9）圖像的采集與分析將膠片進行掃描，用凝膠圖象處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。

2.7 RT-PCR檢測各組卵巢顆粒細胞中akt基因表達量

2.7.1 提取各實驗組大鼠卵巢顆粒細胞的RNA

1）將細胞全部收集，去掉上清后，加入400 ul RNA Lysis Buffer，并重懸細胞；

2）向上一步混合液中加入等體積的無水乙醇，并混勻；

3）將上述混合液過IIC柱；并12 000 rpm離心1 min；棄廢液；

4）向 IIC 中 加入 400 ul RNA Wash Buffer，并12 000 rpm離心1 min；

5）向IIC中加入40 ul預先配制的DnaseI Reaction Mix（5 ul DnaseI+40 ul DNA Digestion Buffer），室溫放置15 min，然后離心；

6）加 400 ulRNA Prep Buffer，并 12 000 rpm 離心1 min；

7）加700 ulRNA Wash Buffer，并12 000 rpm離心1 min；

8）加400 ulRNA Wash Buffer，并12 000 rpm離心3 min；

9）加入25 ul Dnase/Rnase-Free Water洗脫RNA。

2.7.2 RNA濃度測定

提取好的RNA，濃度測定結果如下：OD值符合要求。

2.7.3 反轉錄

反應條件：42℃，60 min；70℃,10 min（表2）。

2.7.4 熒光定量PCR

待測基因和內參基因每個樣品各做三個重復，并設陰性對照；

反應體系（表3）及條件：

2.7.5 RT-PCR結果統計

所測目的基因與內參基因對比后，用實時熒光定量PCR的相對定量法2-ΔΔCT計算，代表AKT RNA的表達情況。ΔΔCT法計算的相對表達量的公式如下：

ΔCT=CT目的基因-CT內參基因

ΔΔCT=ΔCT檢驗組-ΔCT對照組

相對表達量=2-ΔΔCT

3 結果

3.1 二仙湯含藥血清對卵巢顆粒細胞凋亡形態學觀察

與正常組相比，模型組凋亡十分明顯。與模型組相比，陽性對照組凋亡得到緩解，二仙湯組與模型組相比較凋亡情況也得到改善（圖1）；由此可看出二仙湯含藥血清能抑制順鉑干預后的卵巢顆粒細胞損傷。

表3 反應體系

3.2 TUNEL法觀察二仙湯含藥血清對大鼠卵巢顆粒細胞凋亡形態學影響

與正常組相比，模型組凋亡情況十分明顯。與模型組相比，陽性對照組凋亡情況得到緩解，二仙湯組與模型組相比較凋亡情況也得到改善（圖2）；由此可看出二仙湯含藥血清能抑制順鉑干預后的卵巢顆粒細胞損傷。

3.3 蛋白印跡法檢測各組大鼠卵巢顆粒細胞akt、p-akt蛋白表達量的變化

圖1 觀察各組卵巢顆粒細胞情況

圖2 TUNEL法觀察各組卵巢顆粒細胞凋亡情況

圖3 .1各組卵巢顆粒細胞akt蛋白的表達量的變化

圖3 .2各組卵巢顆粒細胞P-akt蛋白的表達量的變化

表4 各組卵巢細胞中akt、p-akt蛋白表達量分析結果（x±s，n=6）

圖4 各組卵巢顆粒細胞P-akt蛋白的表達量的變化

圖5 各組卵巢顆粒細胞akt蛋白的表達量的變化

圖6 各組卵巢顆粒細胞akt蛋白的表達量的變化

和正常組比較，akt、p-akt蛋白表達量總體趨勢走向、強度、結果相似。使用順鉑造模后的各實驗組中的akt、p-akt蛋白表達量均減少，模型組akt、p-akt蛋白表達量最少，P＜0.05有統計學意義；和模型組比較，各治療組均akt、p-akt蛋白表達量表達增多，但akt、p-akt蛋白表達量均低于正常組，其中二仙湯組akt、p-akt蛋白表達量略低于陽性對照組akt、p-akt蛋白表達量，P＜0.05有統計學意義（表4）。

表5 各組卵巢細胞中akt基因表達量分析結果（x±s，n=6）

3.4 RT-PCR檢測各組大鼠卵巢顆粒細胞akt基因表達量的變化

和正常組比較，使用順鉑造模后的各實驗組中的akt基因表達量均減少，模型組akt基因表達量最少，P＜0.05有統計學意義；和模型組比較，各治療組akt基因表達量表達增多，但akt基因表達量均低于正常組，其中二仙湯組akt基因表達量略低于陽性對照組akt基因表達量，P＜0.05有統計學意義（表5）

圖7 AKT基因擴增曲線

圖8 AKT基因溶解曲線

4 討論

本課題組前期實驗已經探索到二仙湯能夠升高大鼠血清中激素水平，降低由順鉑所致的細胞凋亡[8]；明確二仙湯能夠提高各組大鼠卵巢顆粒細胞中bcl-2蛋白的表達，降低各組大鼠卵巢顆粒細胞中bax蛋白的表達；考慮二仙湯可能通過改善激素水平，抑制卵巢儲蓄功能破壞，通過調控凋亡調控蛋白，最終起到改善卵巢功能的作用[9]。為了進一步了解二仙湯經pI3k/akt信號通路在臨床治療中的作用機制，本實驗通過選取22-24 d大鼠原代培養顆粒細胞并用順鉑造模的方法建立大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的模型，經補佳樂及二仙湯含藥血清干預。運用分子生物學方法研究各實驗組AKT的表達及變化。探討二仙湯含藥血清通過AKT途徑介導順鉑所致卵巢顆粒細胞凋亡的保護機制。

本次實驗采用TUNEL檢測技術觀察各組卵巢顆粒細胞凋亡情況。結果顯示：與正常組相比，模型組凋亡率明顯增加。與模型組相比，陽性對照組凋亡情況及二仙湯組凋亡情況均有改善。提示二仙湯可以有效地降低順鉑損傷后的卵巢顆粒細胞的凋亡。蛋白印跡法檢測各實驗組akt、p-akt蛋白表達量。結果顯示：和正常組比較，順鉑造模后的各實驗組中的akt、p-akt蛋白表達量均減少，模型組akt、p-akt蛋白表達量最少，P＜0.05有統計學意義；和模型組比較，各治療組均akt、p-akt蛋白表達量表達增多，但akt、p-akt蛋白表達量均低于正常組，其中二仙湯組akt、p-akt蛋白表達量略低于陽性對照組，P＜0.05有統計學意義。提示二仙湯含藥血清可以抑制順鉑損傷的大鼠卵巢顆粒細胞凋亡情況，考慮可能是因為二仙湯可能通過AKT途徑提高akt、p-akt的表達，影響下游靶蛋白，最終起到保護卵巢的作用。RT-PCR檢測檢測各實驗組akt基因表達水平與蛋白印跡表達相一致。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是與細胞調亡和細胞増殖關系非常密切的信號傳導通路之一，其主要作用有（1）誘導缺氧誘導因子1的表達和活性；（2）是細胞內重要的信號轉導途徑，與多個蛋白或激酶參與細胞生理功能的調節；（3）參與細胞生長、存活、增殖、調亡、血管生成、自噬等過程中，發揮著極其重要的生物學功能[10]。AKT又稱PKB，是PI3K下游一種主要的效應蛋白，其在PI3K/AKT/mTOR這一個信號通路中處于中心環節。在正常的生理狀態下，活化的AKT通過磷酸化多種酶、激酶和轉錄因子等下游因子，從而調節細胞的功能。在PI3K/AKT/mTOR信號通路的異常激活過程中，AKT通過直接磷酸化下游靶蛋白mTOR，而活化后的mTOR進一步磷酸化激活其下游的靶分子，從而促進細胞周期的進展[11]。AKT被磷酸化之后可通過進一步誘導Bax/Bcl-2、Caspase3/8/9和FOX家族磷酸化，并抑制它們的活化，通過這樣來起到抑制細胞調亡的作用；AKT可進一步促進腫瘤壞死因子以及環氧化酶-2誘導的血管生成和內皮細胞遷移[12]。

二仙湯可以有效地降低經順鉑損傷后的大鼠卵巢顆粒細胞的細胞凋亡，保護顆粒細胞，能夠減緩卵巢儲備功能下降，起到很好的治療效果。考慮可能是因為二仙湯通過AKT途徑提高akt、p-akt的表達，影響下游靶蛋白，通過調節PI3K/AKT信號通路而達到保護卵巢的作用。