喜馬拉雅紫茉莉總多糖和總黃酮的提取與含量測(cè)定＊

俞越童，李 健，曹光昭，陳慧榮，鄒慧琴＊＊，閆永紅＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102488；2.北京天健晟峰醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司 北京 100000）

喜馬拉雅紫茉莉?yàn)樽宪岳蚩浦参锵柴R拉雅紫茉莉Mirabilis himalaica(Edgew.)Heim.的干燥根[1]，具有引黃水、益腎滋補(bǔ)、利尿排石等多種功效，常用于腎寒浮腫、下腹痛、腰及關(guān)節(jié)痛、膀胱結(jié)石、各種性病及一些病毒性感染疾病[4-5]。該藏藥歷史悠久，在多種藏醫(yī)成藥中為主要藥味。目前，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)喜馬拉雅紫茉莉中含有黃酮，多糖，苯丙酸衍生物，類固醇，類胡蘿卜素，有機(jī)酸，木質(zhì)素等化合物[6-8]，一些學(xué)者對(duì)其中某些化學(xué)成分進(jìn)行了含量測(cè)定，如：李蘭茹等[9]以沒食子酸為對(duì)照品，用福林酚比色法測(cè)定了喜馬拉雅紫茉莉總多酚的含量；李健等[10]對(duì)喜馬拉雅紫茉莉中總皂苷類成分的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選;索朗其美等[11]采用紫外分光光度法測(cè)定了總黃酮的含量。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道喜馬拉雅紫茉莉乙醇提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞株A549和HCT8具有強(qiáng)生長抑制作用[12]，Li Xue等[13]又分離出6種新的類黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)其中一種化合物對(duì)癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性，表明喜馬拉雅紫茉莉中黃酮類為有效成分。近些年來發(fā)現(xiàn)多糖類成分具有抗病毒，抗腫瘤，降血糖，降血脂，抗衰老，免疫調(diào)節(jié)等功效[14]，但當(dāng)前還沒有關(guān)于喜馬拉雅紫茉莉總多糖含量測(cè)定的報(bào)道，因此，本文采用單因素及正交試驗(yàn)法優(yōu)選總多糖和總黃酮的最佳提取工藝，紫外分光光度法測(cè)定喜馬拉雅紫茉莉中總多糖和總黃酮的含量，旨在為評(píng)價(jià)喜馬拉雅紫茉莉的藥材質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材與試劑

喜馬拉雅紫茉莉（采于拉薩奪底溝山坡下，海拔3 600 m，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)生藥鑒定系閆永紅教授鑒定為紫茉莉科植物喜馬拉雅紫茉莉Mirabilis himalaica(Edgew.)Heim.的根），D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（購于中國食品藥品檢定研究院），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：100080-200707，購于中國食品藥品檢定研究院），乙醇，苯酚，濃硫酸，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉等試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.2 儀器

U-3010紫外分光光度計(jì)（日本日立）；BP211D型1/100電子分析天平（德國賽多利斯）；HH-2型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）、RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），KQ-500DE型超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 喜馬拉雅紫茉莉總多糖的含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品13.64 mg，至25 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，制成0.5456 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

稱取2.0 g喜馬拉雅紫茉莉藥材粉末（過2號(hào)篩），用80%乙醇50 mL于60℃水浴回流1 h，過濾，棄去濾液，濾渣用80 mL蒸餾水100℃水浴回流2小時(shí)，提取2次。合并提取液，揮干溶劑，用蒸餾水定容至25 mL。

2.1.3 苯酚-濃硫酸比色法測(cè)定喜馬拉雅紫茉莉總多糖含量[15]

精密吸取1.0 mL樣品至25 mL容量瓶中，蒸餾水定容，制成樣品溶液。吸取0.2 mL樣品溶液至具塞試管，加水至1 mL，加入5%苯酚1 mL，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，置冷水浴中降至室溫后，置沸水浴加熱15 min，再置于冷水浴中降至室溫，隨行做空白對(duì)照，于490 nm測(cè)吸光度。

2.2 總多糖的方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。精密吸取 0.00、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL稀釋后的對(duì)照品溶液于具塞試管中，按3.1.3項(xiàng)下自“加水至1 mL”后同法測(cè)定吸光度。計(jì)算得出回歸方程：A=63.215C+0.038（r=0.9985）。結(jié)果顯示，在0.003-0.011 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2.2 重復(fù)性考察

取樣品6份，按“3.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，測(cè)定總多糖含量，結(jié)果RSD為1.217%，表明本法重現(xiàn)性良好。

2.2.3 精密度考察

取供試品溶液，連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD為0.171%，表明本法精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性考察

取一份樣品，按“3.1.2”項(xiàng)下制成供試品溶液，分別于0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h測(cè)定總多糖含量，結(jié)果RSD為1.972%。說明樣品吸光度在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率考察

精密稱取已知總多糖含量為5.305%的喜馬拉雅紫茉莉藥材粉末6份，加入5 mg的D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，按“3.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，測(cè)定總多糖含量，計(jì)算回收率，結(jié)果平均加樣回收率為99.393%，RSD為3.716%。

2.3 總多糖單因素試驗(yàn)考察

本實(shí)驗(yàn)分別考察了提取溶劑體積、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)總多糖提取率的影響，選出單因素下的最優(yōu)條件，為下一步正交試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

2.3.1 樣品預(yù)處理

稱取樣品粉末2 g（過二號(hào)篩），用80%乙醇50 mL于60℃水浴回流1 h，過濾，取濾渣備用。

2.3.1 提取溶劑體積對(duì)總多糖的收率影響

按“3.3.1”項(xiàng)下處理樣品，恒定提取次數(shù)2次，提取時(shí)間1.5 h，提取溫度80℃，分別選取溶劑體積40 ml、60 ml、80 ml、100 mL提取濾渣，結(jié)果總多糖收率分別為6.858%、8.674%、11.867%、10.399%。結(jié)果表明溶劑體積80 ml時(shí)，總多糖收率最高，故選擇溶劑體積為80 ml。

2.3.2 提取溫度對(duì)總多糖提取率的影響

按“3.3.1”項(xiàng)下處理樣品，恒定固液比（g：mL）1∶40，提取次數(shù)2次，提取時(shí)間1.5 h，分別在40℃、60℃、80℃、100℃下提取濾渣，結(jié)果總多糖收率依次為5.144%、5.959%、9.413%、11.280%。結(jié)果表明，總多糖收率在100℃時(shí)最高，故選擇100℃為提取溫度。

2.3.3 提取時(shí)間對(duì)總多糖提取率的影響

按“3.3.1”項(xiàng)下處理樣品，恒定固液比（g：mL）1∶40，提取次數(shù)2次，提取溫度100℃，依次考察提取時(shí)間0.5 h，1 h，2 h，3 h下總多糖收率，結(jié)果為5.013%、8.979%、8.446%、7.986%。結(jié)果表明，總多糖提取率在提取1 h時(shí)達(dá)到峰值，延長提取時(shí)間反而有下降趨勢(shì)，故選擇每次提取時(shí)間為1 h。

2.3.4 提取次數(shù)對(duì)總多糖提取率的影響

按“3.3.1”項(xiàng)下處理樣品，恒定固液比（g：mL）1∶40，提取時(shí)間1 h，提取溫度100℃，考察提取次數(shù)為1次、2次、3次、4次下總多糖收率，結(jié)果依次為6.060%、13.329%、11.075%、8.735%。結(jié)果表明，總多糖提取率在提取2次時(shí)達(dá)到峰值，故選擇提取2次。

2.4 正交試驗(yàn)考察

通過單因素試驗(yàn)，最后固定提取次數(shù)2次，確定三因素三水平：提取溫度A（80℃、90℃、100℃），提取時(shí)間B（1 h、1.5 h、2 h）和溶劑體積 C（60 mL、80 mL、100 mL）。采用L9(34)正交表考察最佳工藝條件，正交實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，方差分析見表2。

由表1可知，各因素對(duì)總多糖收率的影響順序?yàn)樘崛囟龋咎崛r(shí)間＞溶劑體積，提取工藝為A3B3C2時(shí)總皂苷的含量最高，為13.769，表2的方差分析結(jié)果表明提取溫度對(duì)總多糖收率影響顯著，其他因素?zé)o顯著影響，所以，最佳工藝組合為A3B3C2，即提取溫度100℃、每次提取2小時(shí)、溶劑體積為80 mL。測(cè)得總多糖含量為13.769%。

2.5 喜馬拉雅紫茉莉總黃酮的含量測(cè)定

2.5.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品12.43 mg，至25 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，制成0.4971 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.5.2 供試品溶液的制備

稱取1.0 g喜馬拉雅紫茉莉藥材粉末(過4號(hào)篩)，用60%乙醇20 mL超聲提取30 min，過濾取續(xù)濾液，即得。

2.5.3 亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測(cè)定喜馬拉雅紫茉莉總黃酮顯色方法

精密吸取1.0 mL樣品溶液至25 ml容量瓶中，加水5 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，6 min后加入10%Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，6 min后加入10%NaOH溶液5 mL，蒸餾水定容，隨行做空白對(duì)照，10 min后于510 nm測(cè)吸光度。

2.6 總黃酮的方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察

精密吸取0.00、1.00、1.40、1.80、2.20、2.60、3.00 mL對(duì)照品溶液于25 mL容量瓶中，按“3.5.3”項(xiàng)下“自加水5 mL”后同法測(cè)定吸光度。計(jì)算得出回歸方程：A=13.303C-0.007(r=0.9995)。結(jié)果顯示，在 0.020-0.060mg?mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

表1 喜馬拉雅紫茉莉總多糖提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 喜馬拉雅紫茉莉總多糖方差分析

2.6.2 重復(fù)性考察

取樣品6份，按“3.5.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果RSD為1.009%，表明本法重現(xiàn)性良好。

2.6.3 精密度考察

取供試品溶液，連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD為0.126%，表明本法精密度良好。

2.6.4 穩(wěn)定性考察

取一份樣品，按“3.5.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果RSD為1.635%。說明樣品吸光度在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 加樣回收率考察

精密稱取已知總皂苷含量為3.522%的喜馬拉雅紫茉莉藥材6份，加入3.5 mg的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，按“3.5.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算回收率，結(jié)果平均加樣回收率為99.047%，RSD為2.656%。

表3 喜馬拉雅紫茉莉總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 喜馬拉雅紫茉莉總黃酮方差分析

2.7 總黃酮單因素試驗(yàn)的考察

本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑濃度、提取溶劑體積、提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響，選出單因素下的最優(yōu)條件，為下一步正交試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

2.7.1 提取溶劑濃度對(duì)總黃酮收率的影響

稱取樣品粉末1 g（過2號(hào)篩）5份，恒定溶劑體積為20倍量，分別用40%、50%、60%、75%、90%乙醇超聲提取30 min，計(jì)算總黃酮收率，結(jié)果分別為1.256%、1.456%、1.333%、1.239%、1.073%。結(jié)果表明，總黃酮收率在提取乙醇濃度為50%時(shí)達(dá)到峰值，故選擇50%乙醇為提取溶劑。

2.7.2 提取溶劑體積對(duì)總黃酮收率的影響

稱取樣品粉末1 g（過2號(hào)篩）5份，分別用10 mL、20 mL、30 mL、40 mL的50%乙醇進(jìn)行超聲提取30 min，結(jié)果總黃酮收率分別為1.248%、1.345%、1.296%、1.278%。結(jié)果表明，總黃酮收率在提取乙醇體積為20 mL時(shí)達(dá)到峰值，故選擇提取溶劑體積為20 mL。

2.7.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮收率的影響

稱取樣品粉末1 g（過2號(hào)篩）5份，用50%乙醇20 mL，分別超聲提取30、60、90、120 min，計(jì)算總黃酮收率，結(jié)果分別為1.422%、1.460%、1.401%、1.328%。

結(jié)果表明，總黃酮收率在提取時(shí)間為60 min時(shí)達(dá)到峰值，故選擇提取時(shí)間為60 min。

2.8 總黃酮正交試驗(yàn)考察

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定溶劑體積為20 ml，確定三因素三水平：乙醇濃度A（40%、50%、60%），提取時(shí)間B（30 min、45 min、60 min），樣品粒度C（2號(hào)篩、3號(hào)篩、4號(hào)篩）。采用L9(34)正交表考察最佳提取工藝。正交實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。

由表3可知，各因素對(duì)總黃酮收率的影響順序?yàn)闃悠妨６龋疽掖既芏龋咎崛r(shí)間，表4的方差分析結(jié)果表明三個(gè)因素對(duì)總黃酮收率影響均無顯著性差異。因此，出于提高收率和節(jié)省時(shí)間兩方面考慮，選擇最佳工藝組合為A3B1C3，即提取乙醇濃度60%，提取時(shí)間30 min，樣品粉碎過4號(hào)篩。測(cè)得總黃酮含量為2.048%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用水浴回流方法提取經(jīng)80%乙醇提取過的喜馬拉雅紫茉莉粉末濾渣，苯酚-濃硫酸比色法測(cè)定總多糖含量，優(yōu)選出最佳提取工藝為40倍量蒸餾水，100℃熱回流2小時(shí)，提取兩次。此方法測(cè)定喜馬拉雅紫茉莉總多糖含量簡便易行，結(jié)果穩(wěn)定可靠，優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定可行。已有文獻(xiàn)報(bào)道采用乙醇超聲提取總黃酮，優(yōu)選出最佳工藝為45%乙醇、料液比1∶25、每次提取55 min、提取3次[16]，本實(shí)驗(yàn)固定提取次數(shù)2次，考察了樣品粒度，溶劑濃度，提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響，優(yōu)選出最佳提取工藝為樣品粉碎過4號(hào)篩、加入20倍量60%乙醇超聲提取30 min。縮小了粉末的粒度，使黃酮類成分更容易溶出，縮短了提取時(shí)間，方法簡便易行，節(jié)省成本，省時(shí)省力。

本文建立了喜馬拉雅紫茉莉總多糖和總黃酮的含量測(cè)定方法和提取工藝，為喜馬拉雅紫茉莉藥材的進(jìn)一步開發(fā)，使用提供可參考的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。