近紅外無損檢測安胎丸中關鍵質控指標成分的含量＊

馬晉芳，王雪利，肖 雪，彭 銀，葛發歡＊＊

（1.中山大學藥學院 廣州 510006；2.中山大學南沙研究院 廣州 511458；3.廣東藥科大學 廣州510006；4.廣東省中藥超臨界流體萃取工程技術研究中心 廣州 510006）

中藥市場中，當進行藥品抽樣檢驗時，只是從大量樣品中隨機抽取少量樣品進行質量檢測，并不能代表產品的整體質量，且檢驗方法復雜，耗時費力，便利性較差。如安胎丸，是古代經典方劑，由當歸、制川芎、黃芩、炒白芍、白術打粉加工制成的中藥復方制劑，具有安胎功效，用于妊娠血虛、胎動不安、面色淡黃、不思飲食、神疲乏力等病癥[1]。每盒裝為10丸，每丸6 g。當前安胎丸的檢驗，是依照《衛生部藥品標準?中藥成方制劑》進行性狀、顯微鑒別、薄層鑒別以及丸劑的各項規定檢查[2]。在目前的文獻報道中，僅通過指紋圖譜[1]及1-3個指標性成分的定量[3-6]評價安胎丸的質量。檢測指標少，不能涵蓋組方藥材，且檢測手段需要進行繁瑣的前處理，有必要開發一種快速、簡便、無損的檢測方法。

近紅外光譜法是一種利用化學物質在近紅外譜區內的光學特性快速測定物質化學組分含量的光譜技術[7-8]。其特點是吸收系數較低、無損、快速、無污染，可以直接對樣品進行測定，不需要對樣品處理或僅需簡單處理[9]。本研究中，采用近紅外漫反射光譜無損檢測的方法，即光投向安胎丸后，在丸劑內部發生方向不定的反射[10]，直接對其進行檢測。待近紅外漫反射光譜穿透至一定深度的蜜丸時，獲得更加完整的安胎丸整體信息，再結合化學計量學方法，對多批安胎丸中的每一丸進行關鍵質控指標成分的定量研究，建立一種抽樣檢驗過程中更具有代表性的近紅外快速無損檢測安胎丸關鍵質控指標成分含量的方法。

1 材料和方法

1.1 儀器和藥材

UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國Thermo公司）；十萬分之一分析天平（XS205 DuaLRange型，梅特勒-托利多）；紫外分光光度計（UV-2600，島津（中國）有限公司）；近紅外光譜儀（SupNIR1500，聚光科技（杭州）有限公司）；化學計量學分析系統（THUNIR V3.0，清華大學），在線監測分析系統（THU NIR Online，清華大學）；阿魏酸（純度99.00%）、黃芩苷（純度93.50%）、漢黃芩苷（純度98.80%）、黃芩素（純度98.50%）、漢黃芩素（純度98.0%）和洋川芎內酯A（純度98.0%），均購自于中國食品藥品研究院。乙腈（色譜級，購于德國默克公司），甲酸（分析純，廣州化學試劑廠）、甲醇及其它試劑均為分析純。安胎丸（批號為：151101、151002、130701、151001、130602、130501、131101、131201、140401、140402、130601、140404，江西保利制藥有限公司）。

1.2 關鍵質控指標成分實際值的測定方法[11]

1.2.1 混合標準品溶液的制備

精密稱取各標準品于容量瓶中，加適量甲醇溶解配制成混合標準品母液，并稀釋至如下濃度：阿魏酸0.00306 mg?mL-1、黃芩苷0.10250 mg?mL-1、漢黃芩苷0.01840 mg ?mL-1、黃芩素 0.064 mg ?mL-1、漢黃芩素0.0378 mg?mL-1、洋川芎內脂0.00715 mg?mL-1、白術內酯0.042 mg?mL-1。

1.2.2 樣品溶液的制備

取1丸安胎丸，剪碎，取約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，稱量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，再稱量，用甲醇補足減失的量，搖勻，即得供試品溶液（平行制備三份）。

1.2.3 色譜條件[11]及測定方法

色譜柱Diamonsil Plus C18-A(250×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.1%磷酸溶液（A）：乙腈（B），梯度洗脫（0-15 min，5%-20%B；15-40 min，20%-40%B；40-45 min，40%-70%B；45-55 min，70%-90%B；55-60 min，90%-95%B）；流速 0.8 mL·min-1；柱溫 35℃；檢測波長280 nm；根據六種關鍵指標成分的化學結構公式(圖1)，達到了令人滿意的分離效果。樣品和標準溶液采用0.45 μm微孔膜過濾，分別取10 μL經HPLC檢測。所測得的數值作為六種關鍵質控指標性成分的含量真實值。

混合標準品溶液和樣品溶液均經HPLC儀測定安胎丸中關鍵質控指標成分的含量。

1.3 關鍵質控指標成分的近紅外測定方法

1.3.1 近紅外光譜數據的采集

取12批（共108丸）的安胎丸樣品，采用近紅外光譜儀進行近紅外光譜數據的采集，按如下條件掃描：漫反射模式，分辨率2 nm，掃描次數32次，波長掃描范圍1000-1800 nm。每丸重復掃描3次，得出平均的準確的光譜數據保存為txt格式，并轉換為CVS格式。

1.3.2 光譜的預處理

光譜預處理對于獲得可靠、穩定和準確的模型至關重要，因為近紅外的光譜的數據中可能包含噪聲、背景信息和其他干擾因素[12]。本研究中，分別近紅外采集的光譜進行了預處理，比較了一階導數卷積（1stderivative，1DC）、二階導數卷積（2ndderivative，2DC）、多元散射校正（Multiplicative Scatter Correction，MSC）、標準正變變換（Standard Normal Variate，SNV）、Savitzky-Golay卷積平滑（S-G）和歸一化法（Normalization Method）等光譜預處理方法。

1.3.3 模型的建立及預測方法

采用THUNIR軟件[13-14]，根據HPLC測定的六種關鍵質控指標成分的真實含量值，對采集到的光譜進行光譜預處理和波段選擇，選擇偏最小二乘法（partial least squares，PLS）[15]，建立六種成分的定量校準模型。

模型的優劣主要以交叉驗證標準誤差（SECV）和相關系數（R2）進行評估[12-13]。

采用建立的定量校正模型，對安胎丸中六種關鍵質控指標成分的含量進行預測，并與HPLC測定結果進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 關鍵質控指標成分的實際值測定

2.1.1 HPLC測定的標準曲線及方法學考察

采用高效液相色譜法繪制了安胎丸六種關鍵質控指標成分的標準曲線：阿魏酸：Y=56.5343 x+56.5343（0.0006-0.0245 μg）；黃芩苷：Y=43.9359 x+43.9359（0.0205-0.8200 μg）；漢 黃 芩苷 ：Y=57.4254 x+57.4254（0.0092-0.1840 μg）；黃芩素：Y=87.5326 x+87.5326（0.0128-0.5120 μg）；漢黃芩素：Y=90.0406 x+90.0406（0.0076-0.3780μg）；洋川芎內酯 A：Y=14.5638 x+0.0075（0.0014-0.1072μg）。

方法學考察中，精密度試驗的RSD值為0.53%-0.85%、重復性試驗的RSD值為2.28%-4.71%、穩定性試驗的RSD值為0.75%-4.00%，均低于5%。加樣回收率試驗采用加入100%濃度的六份樣品進行測定，回收率在98%-105%之間，RSD低于3%。實驗結果表明，方法學考察均符合要求，可見該HPLC測定方法的精度高、重復性好、穩定性好、回收率高。

圖2 安胎丸的HPLC圖

表1 安胎丸中關鍵質控指標成分的含量測定表（mg·pill-1）

續表1

表2 安胎丸關鍵質控指標成分的含量測定表（mg·pill-1）

圖2是安胎丸樣品溶液和標準品溶液的HPLC色譜圖，表明六種關鍵質控指標成分不存在有峰干擾，且各成分歸屬于不同的色譜峰，可以準確進行定量，定量結果見表1。

2.2 關鍵質控指標成分的近紅外定量模型的建立

2.2.1 近紅外校正集樣本和驗證集樣本的劃分

針對上述測定的每一批號中各丸所含質控指標成分的含量，將所有的樣本（108丸）分為校準集和預測集。且分別由84個和24個樣本組成，如表2所示，并對校正集或驗證集的六個質控指標成分含量進行比較，校準集的含量范圍更大，且含量數據分布均勻，符合建模條件。

2.2.2 近紅外光譜的特性分析

近紅外光譜分析常用的光譜區域是780-2500 nm，所測特征是分子振動基頻，尤其是伸縮和彎曲振動的倍頻和組合頻吸收帶[15]。圖3顯示了安胎丸的原始光譜圖和預處理光譜圖的光譜。在卷積平滑的光譜預處理中，1150-1210 nm、1300-1500 nm和1450-1600 nm均有較大響應，這與-CH2、和-CH的二級倍頻、-OH的伸縮振動有關[15]。

2.2.3 主成分分析

主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）是一種根據光譜分數對不同樣本進行分類的合適方法，可用于驗證光譜的一致性[16]。圖4顯示了光譜的得分圖。實驗結果顯示，12批次安胎丸從其PCA得分圖看出，兩年內生產的樣本不存在明顯的異常值。因此，108丸安胎丸具有光譜的一致性。

2.2.4 近紅外光譜的預處理和波段選擇

對近紅外光譜儀采集的光譜數據進行光譜預處理，可以消除偏移或基線的變化，從而保證光譜數據和成分之間很好的相關性[13]。在本研究中，選擇光譜掃描范圍為1000-1800 nm。考察幾種光譜預處理方法包括：S-G、1DC、2DC、MSC、SNV等不同預處理方法，最大程度地減少光譜中存在的干擾，并對上述光譜預處理方法進行比較，分別選出最佳光譜預處理方法：六種質控指標成分的最佳光譜預處理方法均為卷積平滑（窗口數為11，擬合次數為3）[17]。

校正模型建立時，有時并不需要所有的光譜數據都參與校正，而只用某些光譜區間就可以得到很好的校正效果，這樣可以減少參與建模的數據量，降低不相關區間的噪音干擾。因此，本研究中，采用化學計量學軟件提供的光譜區間選擇功能，進行不同的波長選擇方法的比較，優選出最佳波段進行模型的建立，最佳波段的優選結果見表3。

圖4 安胎丸全部樣本的近紅外光譜PCA得分圖

2.2.5 模型主因子數的確定

采用PLS方法建立定量分析模型時，主因子數的選擇直接影響到模型的實際預測能力，如果選擇的主因子太少，將會丟失原始光譜較多的有用信息，導致擬合不充分；如果選擇主因子太多，會將測量噪音過多的包括進來，出現過擬合現象，所建模型的預測誤差會顯著增大[18]。本研究以黃芩苷為例，隨著主因子數增加，SECV陡然下降，防止存在過擬合現象，因此，選擇主因子數為7。

2.2.6 建立最佳定量校準模型

定量校正也稱多元校正[19]，是指在物質含量與分析儀器響應值之間建立定量關聯關系。PLS屬于線性方法，是基于有偏估計的方法，能同時對回歸問題進行降維處理[19]。

本研究中根據表1中六種質控指標成分的含量測定結果，采用THUNIR軟件，應用卷積平滑的光譜預處理方法，選擇優化后的最佳波長，結合偏最小二乘法分別建立近紅外光譜測定安胎丸六種成分的定量校正模型。六種成分的定量分析模型參數見表3。

圖5 黃芩苷定量分析校正模型最佳主因子數的選擇

2.3 定量校準模型的驗證

采用建立的六種關鍵質控指標成分的定量校準模型，分別對剩余的24個驗證集樣本進行含量預測，如圖6，結果顯示安胎丸中的六種關鍵質控指標性成分的真實值與預測值高度匹配，其預測的相關系數R2均≥0.90，表明六個模型具有較好的預測能力。

表3 安胎丸質控指標成分最佳模型校正參數

圖6 安胎丸六種質控指標性成分的預測值與真實值擬合圖

3 討論

本研究采用近紅外漫反射光譜分析技術，成功地對安胎丸進行了六種質控指標成分的定量分析，該方法可以無損、快速、準確地對該中成藥進行質量評價。與市場抽樣檢驗方法比較，可以節省大量分析時間及費用，有著良好的市場實用價值和應用前景，為中成藥市場的抽樣檢驗提供新思路和新方法。