近紅外光譜法快速測定山銀花中四種有機酸＊

張 易，方 婷，馬晉芳，凌亞東，彭 銀，葛發歡＊＊

（1.中山大學藥學院 廣州 510006；2.廣東省中藥超臨界流體萃取工程技術研究中心 廣州 510006；3.廣東藥科大學廣州 510006；4.廣州訊動網絡科技有限公司 廣州 510630）

山銀花是忍冬科植物灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.）、紅 腺 忍 冬（Lonicera hypoglauca Miq.）、華南忍冬（Lonicera confusa DC.）或黃褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng）的干燥花蕾或初開的花，為中醫常用藥，應用歷史悠久[1]，具有清熱解毒，疏散風熱的作用，用于治療癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風熱感冒，溫熱發病[2]。山銀花中有機酸的種類主要有咖啡酰奎寧酸類（包括綠原酸、異綠原酸、新綠原酸等）和咖啡酸[3]，其中綠原酸和異綠原酸類成分（異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C等）為山銀花的主要抗菌活性成分[4]。目前多采用高效液相色譜法（HPLC）測定山銀花中綠原酸和異綠原酸成分的含量，并進行質量控制研究[4-6]，該分析方法大多需要破壞樣品，需對樣品預處理、提取、稀釋、檢測分析等復雜步驟，耗時耗力。

近紅外光譜（near-infrared spectroscopy，NIR）分析技術是目前發展最快和最具有前景的過程分析技術之一，結合化學計量學和計算機技術，可實現對藥物化學成分含量預測[7,8]，具有樣品處理簡單、無損耗、快速等諸多優點。已有報道NIR技術測定金銀花藥材和提取過程中多種指標成分的含量[9-11]，但尚未有用該方法同時快速測定山銀花提取過程中多指標成分含量的文獻報道。

本研究將NIR應用于山銀花提取過程中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C含量的快速分析，利用偏最小二乘（PLS）法建立四種有機酸的定量校正模型，模型經評價后用于測定未知樣品（驗證集）四種成分的含量，采用相關系數、預測均方根誤差及相對預測偏差評價NIR預測結果的準確性，建立NIR快速測定山銀花提取過程中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C含量的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

近紅外光譜儀（型號：NGD-U10，廣州訊動網絡科技有限公司）；Matlab2012a版軟件（美國MathWorks公司）；Ultimate 3000 HPLC儀（包括梯度泵SR-3000、自動進樣器WPS-3000、柱恒溫系統TCC-3000、紫外檢測器DAD-3100、色譜工作站變色龍7.2）（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；十萬分之一分析天平（型號：XS205 DuaLRange，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

1.2 材料

山銀花（市售），經中山大學藥學院葛發歡教授鑒定為忍冬科植物山銀花的花蕾，存放于中大南沙研究院；綠原酸（批號：110753-200413，純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所）；異綠原酸A（批號：15041720）、異綠原酸B（批號：15042210）、異綠原酸C（批號：15110702）均采購自成都普瑞法科技開發有限公司，純度≥98%；乙腈（色譜純，德國默克公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 樣品采集

取山銀花粉末約100 g，加3 000 mL水，80℃加熱回流2 h，每隔2 min收集一次提取液，共提取4批，得到240個樣品，其中2批樣品用于建立校正模型，2批樣品用于驗證模型的準確性。

2.2 NIR譜圖的采集

用近紅外光譜儀對待測樣品進行近紅外掃描。波長掃描范圍為950-1 650 nm，每次光譜掃描次數為100次，分辨率為2 nm，每個提取液樣品重復掃描3次。計算光譜平均值。樣品的近紅外圖譜見圖1。

2.3 山銀花提取液中四種有機酸的含量測定

精密稱取各標準品適量，用50%甲醇溶解至刻度，得到混合標準品母液儲備液。然后精密吸取適量儲備液制成不同濃度的混合標準品溶液。色譜柱為Sharpsil-AQC18（250 mm×4.6 mm,5 μm），流動相為A為0.4%磷酸水溶液，B為乙腈，梯度洗脫（0-15 min，15%B，15-30 min，15%-30%B，30-45 min 30%B，45-48 min，30%-15%B），流速為0.5 mLmin-1，柱溫25 ℃，檢測波長：230 nm。取“2.1”項下的樣品，過0.45 nm濾膜，取濾液進行液相分析。四種有機酸的分離度、精密度、重復性和穩定性均符合分析要求。線性方程分別為：y=31.637x-0.076 2（綠原酸）；y=37.035x-0.062 5（異綠原酸 A）；y=29.674x-0.017 7（異綠原酸 B）；y=32.033x-0.062 7（異綠原酸C）。相關系數R2均為1.000。四種成分的校正集和驗證集的HPLC含量及數據分析分別見表1、表2。

圖1 山銀花提取液近紅外圖譜

2.4 定量分析模型的建立

2.4.1 波段的選擇

采用Matlab2012a版軟件進行建模，四種有機酸的建模波段為950-1 650 nm。通過交叉驗證均方根誤差（RMSECV）和預測均方根誤差（RMSEP）對建模波段進行評價[12]。當RMSEP值遠大于RMSECV值時，說明選擇的建模樣品的代表性差，而當RMSEP值遠小于RMSECV值時，表明驗證樣品的代表性差。本文采用全光譜范圍即950-1 650 nm進行建模，從表3可以看出，RMSEP和RMSECV值均較小且接近，說明選擇的樣品具有代表性。因此選擇建模波段為950-1 650 nm。

2.4.2 主因子數的選擇

主因子數的大小對PLS模型的預測效果有顯著影響。主因子數過少，會出現“欠擬合”現象；而主因子數過多則出現“過擬合”現象，兩者均會導致模型的預測能力下降[13]。故本實驗采取內部交叉驗證方法，考察不同主因子數對RMSECV的影響，優選出最佳的主因子數。結果見圖2。結果表明，隨著主因子數增加，RMSECV陡然下降。RMSECV值最小時，對應的四種有機酸的最佳主因子數分別為：19、19、19和18。

2.4.3 模型的建立及外部驗證

表2 四種成分在校正集和驗證集中的HPLC含量測定結果分析

表3 四種有機酸模型的內部交叉驗證及外部驗證結果

為了檢驗校正模型的可靠性與穩定性，除了進行內部交叉驗證以外，還需對模型進行外部檢驗。根據相關性來判斷是否具有異常值。將HPLC法測得的綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C含量值與其950-1 650 nm波段下的NIR譜圖導入軟件，得到四種成分的定量分析模型及其預測值。模型性能評價指標匯總見表3。四種成分的預測值與真實值的相關圖見圖3。當R值越接近于1時，模型的預測越準確；當RMSECV值越小且與RMSEP接近，相對預測偏差RSEP越小時表明模型預測效果越好。結果表明，所建模型的準確性和穩定性良好，校正集樣本均勻地分布在回歸線的兩側，預測值與實測值的線性相關性較好。所建模型對驗證集中四種有機酸含量的預測結果見圖4。四種成分的相對預測偏差RSEP值較小，能夠滿足中藥實際生產過程中分析精度的要求。

3 討論

本研究應用NIR分析技術建立了山銀花提取過程中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B及異綠原酸C四種成分同時快速檢測方法。所構建的PLS定量模型通過初步驗證具有良好的穩定性和精確度，相對預測偏差RSEP在合理范圍內，可用于對未知樣品的預測。

在實際提取過程中，如果采用在線控制系統，只需要掃描山銀花提取物的NIR光譜，并將其代入所建立的定量模型中即可同時快速預測綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B及異綠原酸C成分的含量。樣品分析極其簡單，極大節省了檢測時間（一般一個樣品掃描一次只需1～2 s），提高了分析效率。該方法彌補了傳統HPLC分析存在的費時費力、環境污染等缺陷，具有廣闊的應用前景。

圖2 四種有機酸定量模型的最佳主因子數選擇

圖3 四種有機酸的NIR預測值與HPLC測定值的相關性

圖4 驗證集中四種有機酸NIR預測值與真實值的相對趨勢