王老吉涼茶中試提取過程的近紅外在線檢測研究＊

馬晉芳，肖 雪，王雪利，彭 銀，史慶龍，蔣華壯，葛發(fā)歡＊＊

（1.中山大學藥學院 廣州 510006；2.中山大學南沙研究院 廣州 511458；3.廣東藥科大學廣州 510006；4.廣東省中藥超臨界流體萃取工程技術研究中心 廣州 510006）

涼茶是我國人民在長期預防疾病與保健的過程中，以中醫(yī)養(yǎng)生理論為指導，以多種中草藥為基礎，研制總結出的一類具有清熱解毒、生津止渴等功效的飲料總稱[1-2]。

王老吉涼茶是著名的廣東涼茶之一，主要由金銀花、菊花、仙草、夏枯草、雞蛋花、布渣葉、甘草共七味藥材經過現(xiàn)代工藝制造而成的一種用于清涼祛火，清熱解毒的現(xiàn)代涼茶產品[2]。涼茶中含有多種成分，其有效成分可能為總酚酸類成分[3]。咖啡酸是一種天然的酚類化合物，具有抗氧化、抗輻射等多種功能活性[4]。目前，對王老吉涼茶質量研究較少，有報道采用液質聯(lián)用法分析王老吉涼茶中的成分[5]。在王老吉涼茶的實際生產過程中，如果采用液質聯(lián)用法或高效液相色譜法進行含量測定，分析結果存在滯后性，難以滿足在線分析的要求[6]。

隨著科學技術的進步，目前近紅外在線光譜儀已實現(xiàn)技術成熟化、產業(yè)化，它能提供成分含量、物理化學性質等多個內在質量參數(shù)的在線測量，從而為基于中藥內在成分含量的質量控制模式提供了技術支持。以近紅外在線光譜儀為核心設備，實現(xiàn)中藥生產過程在線檢測，并根據(jù)檢測結果實現(xiàn)生產過程的智能化控制將是中藥生產過程的大勢所趨，將成為中藥現(xiàn)代化生產的核心技術[7-9]。為了進一步提高王老吉涼茶藥材利用率、降低生產成本，因此，引入近紅外光譜技術，對涼茶生產工藝過程中的提取階段中總酚酸和咖啡酸的含量進行研究。本研究采用近紅外光譜在線分析技術，結合偏最小二乘法，對王老吉涼茶中試提取過程進行實時在線檢測研究，為王老吉產品質量檢測提供有效支持。

1 材料和方法

1.1 儀器和藥材

圖1 王老吉涼茶提取過程在線近紅外原始光譜

UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國戴安公司）；XS205 DuaLRange型十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多）；UV-2600紫外分光光度計（島津（中國）有限公司）；Matrix-F近紅外光譜儀（德國布魯克公司）；化學計量學分析系統(tǒng)（THUNIR V3.0（Demo），清華大學），在線監(jiān)測分析系統(tǒng)（THU NIR Online（Demo），清華大學）；中小型提取罐（30L）。乙腈（色譜級，德國默克），甲酸、碳酸鈉（分析級，廣州化學試劑廠）。福林酚溶液（天津市光復精細化工研究所）；咖啡酸標準品（110885-200102，中國食品藥品檢定研究院）；沒食子酸標準品（批號：110831-201605，中國食品藥品檢定研究院）；王老吉涼茶混合藥材（廣州王老吉藥業(yè)股份有限公司提供）。

1.2 樣品制備

提取罐中加入純化水200 L，開啟攪拌，用蒸汽將水加熱到煮沸，將已稱好的10 kg混合藥材投入提取罐中，在溫度90±2℃提取90 min，提取過程中進行近紅外控制時每隔約2 min采樣一次，按樣品采集時間編號，并置于密封容器中存放。

1.3 在線近紅外采集光譜[10-11]

光譜采集條件：選用2 mm光程，以空氣為背景，采用透射模式在線采集提取液吸收光譜，光譜范圍為800-2 500 nm，掃描次數(shù)32次，分辨率2 nm，每個提取液樣品重復掃描3次，得出平均的光譜數(shù)據(jù)，采集的近紅外原始光譜見圖1。

1.4 王老吉涼茶提取液中指標成分的含量測定

1.4.1 王老吉涼茶中總酚酸的含量測定[12]

1.4.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸標準品，加水配制成0.645 mg·mL-1的對照品溶液。

1.4.1.2 供試品溶液的制備

取“1.2”項下樣品各5 mL，再加入5 mL蒸餾水，混勻即可。

1.4.1.3 測定方法

分別精密量取標準品溶液與供試品溶液1 mL，加入1.8 mL福林酚試劑,室溫反應5 min后加入1.2 mL 7.5%碳酸鈉溶液，避光放置1.5 h后于765 nm下，以水為空白測定其吸光度。

1.4.2 王老吉涼茶中咖啡酸的含量測定[13-14]

1.4.2.1 色譜條件

色譜柱 phenomenex Luna 5u C18(2)100A（250×4.6 mm）；流動相體系：乙腈-0.3%乙酸水溶液；流動相A為乙腈，流動相B為0.3%乙酸水溶液，梯度洗脫（0-20 min，7%-20%A；20-30 min，20%-95%A），流速為0.8 mL/min，柱溫35℃，檢測波長：316 nm。檢測器：紫外檢測器DAD-3000，進樣量：20 μL。

1.4.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取咖啡酸標準品，加甲醇配制成濃度為0.214 mg·mL-1的咖啡酸母液。精密量取母液0.8 mL至5 mL容量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻作為對照品溶液。

1.4.2.3 供試品溶液的制備

取“1.2”項下樣品各5 mL，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液。

1.4.2.4 測定方法

分別精密量取標準品溶液與供試品溶液各20 μL，經HPLC測定。

1.5 樣本的在線監(jiān)測分析

采用THU NIR Online（Demo）對王老吉涼茶提取過程中的各個批次進行分析比較，對光譜進行波長選擇，排除噪聲干擾，反應檢測目標成分的變化情況，選擇提取過程趨勢一致的批次進行模型的建立與預測分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

將符合生產條件的樣本劃分為校正集、驗證集及外部預測集，采用多種光譜預處理方法如無預處理、卷積平滑、一階卷積求導、二階卷積求導、歸一化法、多元散射校正、標準正態(tài)變量變換中的一種或幾種對光譜進行優(yōu)化[15-18]。采用多種波長選擇方法，如全波長法、相關系數(shù)法、相關成分法、迭代優(yōu)化法等對光譜進行波長選擇[10,11,17]，采用偏最小二乘法對樣本的光譜數(shù)據(jù)與其性質的含量值做回歸擬合計算，建立校正模型。

1.7 模型評價參數(shù)[19-20]

采用交互驗證標準偏差（SECV）、校正標準偏差（SEC）、主因子數(shù)（LV）、決定系數(shù)（R2）作為指標，評價模型的性能。

2 結果與分析

2.1 提取液中總酚酸測定結果

根據(jù)測定方法中建立的UV-Vis法，對提取液中的總酚酸進行含量測定，方法學主要參考中藥藥典和已報道過的文獻[12]，其精密度、重復性、穩(wěn)定性的RSD值分別為0.82%、2.34%和0.25%，均小于3.0%，平均加樣回收率為97.64%，均符合分析要求，所建立的線性方程為Y=1.4356X+0.0246，R=0.9995，各批次的提取液中總酚酸的測定結果見表1、表3、表5。

2.2 提取液中咖啡酸測定結果

根據(jù)測定方法中建立的液相方法，對提取液中的咖啡酸進行含量測定，方法學主要參考中藥藥典和已報道過的文獻[13-14]，其精密度、重復性、穩(wěn)定性的RSD值分別為0.97%，0.83%和2.97%，均小于3.0%，平均加樣回收率為98.57%，均符合分析要求，所建立的線性方程為Y=78.9692X+0.0302，R=1.0000，各批次的提取液中咖啡酸的測定結果見表2、表4、表6。

2.3 各批次樣本的在線監(jiān)測分析

采用THU NIR Online（Demo）對王老吉涼茶提取過程中的六個批次進行分析比較[21]，光譜波長選擇為834-1830 nm，檢測目標成分的變化情況，如圖2所示為第一批次趨勢變化圖，從左向右，趨勢逐漸趨于平衡，提示達到提取完全。通過比較各個批次，選擇提取過程趨勢一致的五個批次進行模型的建立與預測分析。

2.4 樣本集的劃分

根據(jù)2.3中樣本的在線監(jiān)測分析結果，選出5批符合現(xiàn)場生產條件的樣本進行建模和驗證分析，其中包括118個建模樣本，30個外部驗證樣本，1個批次34個在線驗證樣本。

2.5 近紅外模型的建立

2.5.1 光譜預處理

采用“1.6”中的光譜預處理方法，對所“1.3”中采集的建模原始光譜進行光譜預處理來消除基線漂移，提高信噪比，提取關鍵信息。本研究比較了幾種常用預處理方法，提高了模型的穩(wěn)定性和預測的準確性，結果見表7，交叉驗證相關系數(shù)R越接近1，內部交叉驗證均方差SECV越小，預處理方法越好。最終確定對總酚酸和咖啡酸分別進行卷積平滑預處理，在其所有預處理方法中SECV最小，分別為0.0620和0.0010。

2.5.2 波長的選擇方法

本研究中對總酚酸和咖啡酸的建模波段進行優(yōu)選，結合各成分中分子結構的差異性，通過比較全波長、相關系數(shù)法、迭代優(yōu)化波長選擇方法，優(yōu)選最佳建模波段，并建立數(shù)學模型，確定近紅外光譜與含量的關系。結果顯示迭代優(yōu)化波長選擇方法能最大程度地利用光譜中的有效信息，并消除噪音等因素的影響，因此，對全波長法、相關系數(shù)法、迭代優(yōu)化波長選擇方法進行比較（表8）。結果顯示迭代優(yōu)化波長選擇方法的相關系數(shù)最高，SECV值最小，所以，總酚酸和咖啡酸均選擇迭代優(yōu)化波長選擇方法建立定量模型。

2.5.3 模型維數(shù)的確定

本研究中采用偏最小二乘法建立定量模型，維數(shù)的選擇對模型的預測能力有較大影響。在校正集樣本一定的情況下，維數(shù)過多，則會由于噪音偏大而出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象；維數(shù)過少則會由于包括的信息不完全導致模型的預測能力差。因此，本研究選擇兩個指標成分的模型維數(shù)分別為4和6，結果見圖3。

2.5.4 模型的建立

在線提取液的近紅外光譜分別經卷積求導預處理后，采用迭代優(yōu)化波長選擇方法，運用偏最小二乘法分別建立定量校正模型并分析，結果顯示總酚酸和咖啡酸的相關系數(shù)分別為0.9759和0.9664，內部交叉驗證均方差SECV分別為0.0620和0.0010，具體模型的參數(shù)見下表。

2.6 模型的外部驗證與在線驗證

選取30個樣本作為外部驗證集，34個樣本作為在線驗證集，預測總酚酸和咖啡酸的含量，并與高效液相法測定值進行比較，驗證校正模型的準確性，預測值與真實值的擬合結果見圖4，相關系數(shù)均大于0.85，說明預測值和真實值相對吻合，可見總酚酸和咖啡酸的定量校正模型具有良好的預測能力。

3 討論

通過建立的近紅外光譜校正模型，獲得的王老吉涼茶提取液中總酚酸和綠原酸近紅外預測值與HPLC測定值基本一致，且預測值的變化趨勢也與在線提取過程的含量相符合。結果證實了近紅外光譜在線技術在王老吉涼茶的中試提取過程中應用的可行性，為下一步在王老吉涼茶的大生產過程中實施近紅外在線動態(tài)質量監(jiān)控提供了研究基礎。

此外，本實驗采用同一批次的藥材作為研究對象，整體預測效果較好，但仍存在有個別異常光譜，分析原因，不排除提取過程中循環(huán)設備儀器引起的遮光現(xiàn)象。這也提醒在后續(xù)研究工作特別是在線過程分析中要充分考慮各種干擾因素。

表1 建模樣本中總酚酸含量測定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

表2 建模樣本中咖啡酸含量測定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

表3 外部驗證集樣本中總酚酸的含量測定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

表4 外部驗證集樣本中咖啡酸的含量測定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

表5 在線驗證集樣本中總酚酸的含量測定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

表6 在線驗證集樣本中咖啡酸的含量測定數(shù)據(jù)（mg·mL-1）

圖2 第一批次的總酚酸在線監(jiān)測分析圖

表7 光譜預處理方法的比較

表8 波長選擇方法的比較

圖3 模型維數(shù)圖

表9 兩個成分的模型參數(shù)

圖4 定量校正模型外部驗證與在線驗證圖