包裝方式對牛肉貯藏過程中蛋白質氧化及降解的影響

扶慶權，張萬剛，宋尚新，王海鷗，陳守江

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包裝方式對牛肉貯藏過程中蛋白質氧化及降解的影響

扶慶權1，張萬剛2，宋尚新1，王海鷗1，陳守江1

（1. 南京曉莊學院食品科學學院，南京 211171；2. 南京農業大學食品科技學院/肉品加工與質量控制教育部重點實驗室/食品安全與營養協同創新中心，南京 210095）

為探明托盤透氧包裝（air packaging, AP）和高氧氣調包裝（modified atmosphere packaging, MAP, 80% O2+20% CO2）對宰后牛肉貯藏過程中對牛肉嫩度影響的潛在機制，以真空包裝（vacuum packaging, VP）為對照，選取6 頭西門塔爾純種母黃牛背最長肌，分別進行托盤透氧包裝、真空包裝和高氧氣調包裝，4℃冷庫分別貯藏0、4、7、10 d，分別測定蛋白羰基含量及分布、蛋白表面疏水性值、蛋白質溶解度值以及肌間線蛋白和肌聯蛋白的降解變化。結果表明：相對于真空包裝組，托盤包裝組和高氧氣調包裝組在宰后貯藏過程中肌細胞外圍出現羰基氧化熒光信號顯著增加，且不斷向細胞內部擴散，說明其蛋白質氧化程度不斷增加；宰后貯藏10 d后，托盤透氧包裝組和高氧氣調包裝組的蛋白質表面疏水性顯著高于真空包裝組（< 0.05），而托盤透氧包裝組和高氧氣調包裝組的蛋白溶解性顯著低于真空包裝組（< 0.05）；宰后貯藏7和10 d，托盤透氧包裝組和高氧氣調包裝組的肌間線蛋白和肌聯蛋白的降解顯著低于真空包裝組（< 0.05），說明托盤透氧包裝組和高氧氣調包裝組抑制了肌間線蛋白和肌聯蛋白的降解（< 0.05）。托盤透氧包裝組和高氧氣調包裝組能夠提高宰后貯藏過程中蛋白質氧化程度，從而抑制其對牛肉骨骼關鍵蛋白的降解，該研究可為牛肉貯藏提供理論支撐。

冷藏；包裝；蛋白質；牛肉；托盤包裝；高氧氣調包裝；真空包裝；蛋白質氧化；蛋白質降解

0 引 言

中國是冷鮮肉和肉制品生產和消費大國，而冷鮮肉在冷藏貯藏過程中，由于肉質變得柔嫩多汁且具有良好氣味和滋味，已成為國內外消費的主流[1]。近年來，冷鮮肉在生鮮肉的生產和銷售中所占的比例不斷增大。隨著社會經濟的發展和人民生活水平的提高，冷鮮肉將是今后鮮肉發展的必然趨勢。

目前，在冷鮮肉生產和銷售過程中，為了滿足不同顧客的需要，不同包裝方式冷鮮肉應運而生。最常見的包裝形式主要有透氧托盤包裝、真空包裝和高氧氣調包裝。這些包裝技術的主要作用于防止二次污染、抑制微生物的生長繁殖、提高產品的嫩度和顏色等感官品質，抑制蛋白質氧化和脂肪氧化，減少質量損失，提高產品經濟價值[2-3]。真空包裝是市場上鮮肉常用的一種包裝方式，通常被用于牛肉在運輸過程中進行保鮮。它是將包裝袋內的空氣抽以降低氧氣含量，然后采用密封技術，使包裝內的鮮肉和空氣隔絕，從而保持鮮肉肌紅蛋白本身所具有的紫紅色[4]。托盤透氧包裝是目前肉類超市冷柜中最常見的一種包裝方式。鮮肉切分后采用白色的泡沫聚苯乙烯托盤進行包裝，上面配以無毒的聚氯乙烯或聚乙烯薄膜通過熱封收縮緊貼在托盤上[5]。高氧氣調包裝（80% O2+20% CO2）主要用于小塊牛肉和高價格的牛肉如背部最長肌、腰大肌和半膜肌等的包裝，其主要目的是保持鮮肉穩定的亮紅色和延長貨架期[6]。托盤包裝和80%高氧氣調包裝含有高濃度的氧，在鮮肉冷藏期間潛在引起脂肪氧化和蛋白質氧化，而蛋白質氧化能夠降低鮮肉的品質如嫩度和多汁性[7-8]。

蛋白質氧化是通過活性氧或氧化應激的副產物引起蛋白質的共價修飾，從而能夠引起蛋白質結構和功能的改變[9]。在鮮肉的加工和貯藏過程中，蛋白質氧化是導致產品品質下降的主要原因。蛋白質氧化可以導致蛋白質交聯、氨基酸側鏈修飾和蛋白質片段的形成[10]。蛋白質氧化修飾的程度主要通過羰基衍生物的形成、巰基的損失以及分子內和分子間交聯的程度來評價。前期已研究證實，蛋白質氧化能夠抑制-鈣蛋白酶的活性從而影響其對鮮肉關鍵骨架蛋白的降解速率和程度，從而進一步影響鮮肉肌細胞內水分的分布狀態以及嫩化程度[11-12]。

然而，托盤包裝、真空包裝和80%高氧氣調包裝3種包裝條件下蛋白質氧化調控牛肉品質的機理目前還不清楚，尤其是3種包裝方式對牛肉肌細胞蛋白氧化的分布情況以及關鍵骨架蛋白的降解目前還未有報道。因此，本文主要是探討3種不同包裝方式下蛋白質氧化對宰后牛肉在貯藏過程中的氧化修飾的影響以及對關鍵骨骼蛋白降解的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗選取體質量基本相當的母黃牛（西門塔爾純種）6頭，月齡均為18個月。所有黃牛均在阜陽雨潤食品有限公司屠宰，胴體稱質量后送入4℃冷庫排酸24 h，分別從每頭牛的左半邊胴體的第13根肋骨到最后一根肋骨處取下背最長肌備用。

聚丙烯托盤、封口膜及真空包裝袋由快衛爾（中國）有限公司生產；DNPH（2,4-二硝基苯肼，2,4-dinitrophenylhydrazine），上海阿拉丁試劑有限公司；CY3-羊抗兔二抗、山羊和兔血清，武漢博士得生物工程有限公司；DNPH抗體（D9556）、肌間線蛋白單克隆抗體（ab8976）和HRP（辣根過氧化物酶，horseradish peroxidase）標記羊抗鼠IgG，英國Abcam公司；過氧化物標記的抗鼠免疫球蛋白，美國Bio-Rad公司；PVDF（聚偏二氟乙烯膜，polyvinylidene fluoride）膜，美國Millipore公司；BCA（二喹啉甲酸，bicinchoninic acid）蛋白檢測試劑盒和ECl（電化學發光，elctro-chemi-luminescience）試劑盒，美國Thermo公司；BSA (牛血清白蛋白, bovine serum albumin )，美國Promega公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Turrax T18 Basic高速勻漿機，德國IKA公司； Avanti J-E落地式高速冷凍離心機，美國Beckman Coulter公司； Smart 500氣調包裝機，西班牙Ulma包裝公司；DC800-FB-E真空包裝機，美國快爾衛包裝公司；托盤透氧包裝機，蘇果超市有限公司衛崗店； SpectraMax M2酶標儀，美國 Molecular Devices公司； UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司；LSM 700 META 激光共聚焦顯微鏡，德國蔡司公司；CM1950 超薄冷凍切片機，德國 Leica 公司；PowerPac 1000 垂直電泳儀和Mini-protein Tetra Cell 電泳設備，美國 Bio-Rad 公司；ImageQuant LAS 4000 分子成像系統和 Imagescanner凝膠成像系統，美國 GE公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理與試驗設計

剔除6條背最長肌上面可見脂肪、筋膜和結締組織，將牛肉樣品分割成厚3 cm、長6 cm、質量500 g的肉塊，牛肉樣品充分混合后隨機分成3組，一組進行托盤透氧包裝（PE材料，氧氣透過率>7 000 cm3/m2·24 h·atm，二氧化碳透過率>28 000 cm3/m2·24 h·atm），一組進行真空包裝（PA/PE材料，氧氣透過率<30 cm3/m2·24 h·atm，二氧化碳透過率<120 cm3/m2·24 h·atm），另外一組進行高氧氣調包裝（80 % O2+ 20% CO2，PA/EVOH/PE材料，封口膜氧氣透過率<1 cm3/m2·24h·atm，二氧化碳透過率<5 cm3/m2·24 h·atm）。包裝后的牛肉樣品放在4℃冷庫中貯藏，在0（未包裝樣品）、4、7、10 d到達后分別取樣測定相關的指標。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

宰后貯藏0、4、7、10 d后牛肉肌原纖維蛋白的提取根據Park 等[13]的方法并進行適當的修改。稱取5 g解凍好的凍肉攪碎后，加入25 mL預冷過的肌原纖維蛋白提取緩沖液（2 mol/L MgCl2，100 mol/L NaCl，1 mol/L EGTA，10 mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH值7.0），使用勻漿機在4℃以12 000 r/min的速度勻漿2次，每次15 s，勻漿液于4 ℃ 2 000 g轉速離心10 min。沉淀用20 mL上述緩沖液以同樣的條件重復2次。離心后沉淀用20 mL 100 mol/L NaCl溶液重復洗滌2次，離心后沉淀即為肌原纖維蛋白。沉淀首先溶解在20 mol/L磷酸鹽緩沖液中（含0.6 mol/L NaCl，pH值6.5），采用雙縮脲方法測定肌原纖維蛋白的濃度[14]，肌原纖維蛋白濃度最終調整為8 mg/mL。一部分溶解的肌原纖維蛋白溶液用于測定蛋白質氧化指標，一部分溶解的肌原纖維蛋白溶液與等體積的電泳上樣緩沖液（125 mmol/L Tris-base，4% SDS（十二烷基硫酸鈉，sodium dodecyl sulfate），20%甘油，0.5% MCE（β-巰基乙醇，β-mercaptoethanol），0.1%溴酚藍，pH值6.8）用漩渦器充分混合，最終肌原纖維蛋白的上樣液濃度為4 mg/mL，樣品于95 ℃水浴5 min，取出冷卻后分裝樣品，-80 ℃存放用于蛋白電泳和蛋白免疫印跡測定。

1.3.3 肌細胞內羰基分布測定

牛肉樣品羰基肌細胞的分布測定參考Astruc 等[15]的方法并做一定的修改。將宰后冷藏貯藏0、4、7、10 d后的牛肉樣品，沿肌原纖維方向將牛肉塊切成細長條（長2 cm×寬0.2 cm×高0.2 cm），立即放入液氮中快速冷凍60 s以防止肌肉冰晶形成，平行測定6個牛肉樣品。冰凍超薄切片機將牛肉細長條切成10m厚的薄片，立即加入0.02% DNPH溶液（溶解在20 mmol/L磷酸鹽緩沖液和0.1 mol/L氯化鈉的混合液中，pH值6.0）于暗處反應16 h。反應結束后切片樣品用含0.1%吐溫的磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH值6.75）重復沖洗6次，每次洗滌5 min。切片樣品隨后用10%的兔血清（溶解在20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH值6.0）37℃封閉1 h。移除封閉液，立即加入DNPH多克隆抗體（稀釋100倍）于4℃孵育過夜。孵育結束后切片樣品用含0.1%吐溫的磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH值6.75）重復沖洗6次，每次洗滌5 min。切片樣品用羊血清進行于37℃二次封閉1 h。移除封閉液，加入CY3標記的羊抗兔免疫球蛋白溶液（稀釋50倍）暗處孵育1 h。反應結束后同樣用磷酸鹽緩沖液重復沖洗6次，每次洗滌5 min。采用激光共聚焦顯微鏡觀察肌細胞間羰基分布情況。測試條件為激發波長555 nm，發射波長570 nm，樣品放大200倍，曝光時間相同。

1.3.4 表面疏水性測定

肌原纖維蛋白表面疏水性測定參照Chelh 等[16]的方法并進行適當的修改。宰后貯藏0、4、7、10 d后牛肉樣品提取的肌原纖維蛋白用20 mmol/mL 的磷酸鹽緩沖液（pH值6.0）溶解并調整的至蛋白濃度為2 mg/mL，取出2 mL 蛋白溶液加入40L 1 mg/mL 溴酚藍溶液充分混合，對照組取2 mL的20 mmol/mL 磷酸鹽緩沖液（pH值6.0）同樣加入40L的1 mg/mL 溴酚藍溶液充分混合。樣品和對照品用搖床在室溫震蕩10 min，于4℃條件下以4 000 g 離心15 min，在波長595 nm處測定上清液吸光度值，表面疏水性結果即結合溴酚藍采用公式（1）進行計算。

結合溴酚藍=40× (OD對照組? OD樣品) / OD對照組（1）

1.3.5 蛋白溶解度測定

宰后貯藏0、4、7、10 d后牛肉樣品的溶解度測定參考Joo 等[17]的方法略有改動。肌漿蛋白溶解度測定：1 g碎肉加入0.025 mol/mL（pH值7.2）預冷的磷酸鉀緩沖液，勻漿機以最低速勻漿1 min，放入搖床固定于4℃勻速震蕩過夜，取出勻漿液1 500 g離心20 min，上清液肌漿蛋白溶解度采用雙縮脲方法進行測定。總蛋白溶解度測定：1 g碎肉加入20 mL的0.1 mol/mL（含1.1 mol/mL碘化鉀，pH值7.2）預冷的磷酸鹽緩沖液，按肌漿蛋白同樣的方法和程序進行勻漿、震蕩、離心和測定。肌原纖維蛋白的溶解度為總蛋白溶解和肌漿蛋白溶解度的差值。

1.3.6 肌間線蛋白測定

宰后冷藏0、4、7、10 d后牛肉樣品的肌間線蛋白測定參考Fu 等[18]的方法并進行稍微修改。肌間線蛋白電泳采用4%的濃縮膠和10%的分離膠，按膠孔從左到右邊的順序依次加入4L標準蛋白和30g肌原纖維蛋白分別用來測定目標蛋白的位置和分析不同樣品肌間線蛋白的變化。濃縮膠于恒壓60 V電泳30 min，進入分離膠后增大電壓至120 V 繼續電泳，當溴酚藍跑至分離膠的底部停止電泳。肌間線蛋白在恒壓90 V條件下于4℃轉印120 min，轉印液為10%甲醇, 192 mmol/L甘氨酸和25 mmol/L Tris-base。轉印完成后的聚偏氟乙烯膜放入含有5%脫脂奶粉的TTBS溶液（20 mmol/L Tris-base，137 mmol/L NaCl， 0.05% Tween 20，5 mmol/L KCl）于常溫孵育封閉2 h。肌間線蛋白一抗按1：500的稀釋倍數于4℃條件下孵育反應15 h。反應結束后取出膜并用TTBS溶液反復洗滌6次，每次5 min。聚偏氟乙烯膜置于HRP標記二抗溶液（1：500）中于室溫反應2 h。反應結束后取出膜同樣用TTBS溶液反復洗滌6次，每次5 min。聚偏氟乙烯膜表面用ECL顯色劑在暗箱反應顯色5 min，使用凝膠成像儀掃描曝光并拍照。肌間線蛋白的條帶強度用Quantity one分析軟件進行半定量分析。肌間線蛋白降解的結果用免疫反應的熒光強度值除以對照樣品的熒光強度值所得百分比來表示。

1.3.7 肌聯蛋白測定

宰后冷藏貯藏0、 4、7、10 d后牛肉樣品的肌聯蛋白的降解測定參照Li 等[19]的方法并稍加修改。5%的連續聚丙烯酰胺凝膠電泳（丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺=100:1，1.5 mol/L Tris-base，pH值8.0，0.1% SDS，0.05%過硫酸銨，0.05%四甲基乙二胺），每孔肌原纖維蛋白的上樣量均為20g。每塊膠以恒流4.5 mA常溫電泳20 h電泳結束。采用考馬斯亮藍對肌聯蛋白膠進行固定、染色和脫色，使用凝膠成像儀掃描并拍照。

1.4 數據統計與分析

所有數據均表示為平均值±標準偏差，所有牛肉樣品使用6個重復，每個重復進行3次平行試驗。采用SAS 8.0軟件對所有數據進行分析，不同處理組的差異采用ANOVA的方差分析，平均值的差異比較采用鄧肯的多重比較，每2個數據的均值的差異顯著性采用-檢驗進行（< 0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同包裝方式對牛肉肌細胞內羰基分布的影響

圖1所有樣品白色熒光信號均為牛肉肌細胞中蛋白氧化形成的羰基。不同包裝方式對牛肉貯藏過程中肌細胞內羰基分布的影響如圖1所示。

注：AP，VP和MAP表示托盤透氧包裝、真空包裝、高氧氣調包裝。視野放大倍數均為200倍；標尺表示100 μm。

由圖1可知，宰后冷藏貯藏4 d后，托盤包裝和高氧氣調包裝牛肉樣品的肌細胞四周出現氧化熒光信號，熒光分布不均勻，真空包裝牛肉樣品的肌細胞四周出現少量的氧化熒光信號。宰后冷藏貯藏7 d后，托盤包裝和高氧氣調包裝牛肉樣品的白色熒光信號逐漸增強，且由肌細胞外部逐漸向胞內擴散，真空包裝牛肉樣品的少量的白色熒光分布在肌細胞四周。宰后冷藏貯藏10 d后，托盤包裝和高氧氣調包裝牛肉樣品的肌細胞四周呈現高亮熒光信號，白色熒光部分逐漸向肌細胞內部滲透且熒光信號不斷增強，而真空包裝牛肉樣品的白色熒光信號相對較弱，分布多集中在細胞的周圍。相對于真空包裝，托盤包裝和高氧氣調包裝的牛肉樣品白色熒光信號的增加說明隨著貯藏時間的延長，其羰基含量越來越高，蛋白質氧化程度加劇。蛋白質氧化是活性氧（ROS，reactive oxygen species）直接或間接與蛋白質氧化應激二級產物反應引起蛋白質的共價修飾[9]。活性氧自由基與氨基酸反應或者活性氧氧化氨基酸的殘基側鏈、肽骨架以及功能基團，從而導致蛋白質分子內和分子間的交聯、肽鏈骨架的斷裂或氨基酸側鏈的氧化修飾，導致蛋白質功能的損失和酶活性鈍化[20]。在已有的參考文獻中，大多數作者通常采用氨基酸側鏈形成的蛋白羰基化合物濃度來評估蛋白質氧化的程度，此方法過程繁瑣且測定結果誤差大。

在本試驗中，采用免疫組化的方法同時使用激光共聚焦顯微鏡技術來觀察蛋白質氧化程度，能夠更加清晰明了的觀察到肌細胞氧化的變化過程。隨著貯藏時間的延長，托盤包裝和高氧氣調包裝的牛肉樣品相對托盤包裝其氧化程度加劇，且氧化熒光信號由細胞外逐漸向細胞內滲透。Astruc等[15]通過激光共聚焦來觀測羰基在肌細胞內的熒光分布情況，發現宰后動物體內蛋白氧化起始于細胞膜上蛋白氧化，ROS從肌細胞膜向細胞內部傳遞的過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白逐漸被氧化。

2.2 不同包裝方式對牛肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

溴酚藍同非水溶性蛋白特異性結合被認為是測定肌原纖維蛋白表面疏水性值的一種簡單而可靠的方法，而結合溴酚藍的數量是反應蛋白表面疏水性值的一個指標[16]。3種包裝方式處理的牛肉樣品貯藏4 d后其表面疏水性值無顯著性差異（圖2,> 0.05）。

牛肉樣品貯藏7 d后，托盤包裝牛肉樣品的表面疏水性值顯著高于真空包裝和氣調包裝的牛肉樣品（< 0.05），而真空包裝的牛肉樣品和高氧氣調包裝的牛肉樣品相比無顯著性差異（> 0.05）。牛肉樣品貯藏10 d后，托盤包裝牛肉樣品的表面疏水性值顯著高于真空包裝和氣調包裝的牛肉樣品（< 0.05），而80%高氧氣調包裝的牛肉樣品的表面疏水性值又顯著高于真空包裝的牛肉樣品（< 0.05）。溴酚藍能夠與蛋白質發生反應產生強烈的相互作用，因此它常常作為一種簡單而可靠的方法用來鑒別肌原纖維蛋白構象的變化和特征化表面疏水位點的暴露[21-22]。試驗結果與Chelh等[16]報道的結果具有一致性。Chelh 等發現隨著加熱溫度的增加，蛋白質氧化程度高，豬肉肌原纖維蛋白的表面疏水性也就隨之增加。Santé-Lhoutellier 等[23]研究發現，蛋白質氧化增加了肌原纖維蛋白表面疏水性。蛋白表面疏水性增加表明化學氧化可能引起蛋白質二級結構和三級結構的變化，這些結構的改變由于非極性氨基酸分子進入疏水簇導致了蛋白質分子的展開或者重排[24]。

注：不同字母表示不同包裝方式在相同冷藏時間下差異顯著（P < 0.05），下同。

2.3 不同包裝方式對牛肉蛋白質溶解度的影響

3種包裝方式處理對牛肉樣品宰后貯藏過程中肌原纖維蛋白溶解度、肌漿蛋白溶解度和總蛋白溶解度的影響如圖3所示。

圖3 3種包裝方式在4℃貯藏10d過程中對牛肉樣品肌原纖維蛋白溶解度、肌漿蛋白降解度和總蛋白溶解度的影響

由圖3可知，在牛肉樣品貯藏4 d，3種包裝方式的牛肉樣品的肌原纖維蛋白的溶解度無顯著性差異（> 0.05），而真空包裝牛肉樣品的肌漿蛋白和總蛋白溶解度顯著高于托盤包裝的牛肉樣品（< 0.05）。在牛肉樣品貯藏7 和10 d，真空包裝牛肉樣品的肌原纖維蛋白和總蛋白溶解度顯著高于托盤包裝和高氧氣調包裝的牛肉樣品（< 0.05），而高氧氣調包裝牛肉樣品的肌原纖維蛋白和總蛋白的溶解度顯著高于托盤包裝的牛肉樣品（< 0.05）。在牛肉樣品貯藏7 d，真空包裝牛肉樣品的肌漿蛋白溶解度顯著高于托盤包裝和高氧氣調包裝的牛肉樣品（< 0.05）。而托盤包裝牛肉樣品的肌漿蛋白溶解度和80%高氧氣調包裝的牛肉樣品相比無顯著性差異（> 0.05）。在牛肉樣品貯藏10 d，真空包裝牛肉樣品的肌漿蛋白溶解度顯著高于托盤包裝的牛肉樣品（< 0.05），而托盤包裝牛肉樣品的肌漿蛋白溶解度和高氧氣調包裝的牛肉樣品相比無顯著性差異（> 0.05）。溶解度可用于表征蛋白質變性聚集和交聯程度。氧化可以改變蛋白質的天然構象導致溶解度降低。在本文研究中，托盤包裝和80%高氧氣調包裝的牛肉樣品在宰后貯藏過程中相對于真空包裝其蛋白質溶解度的下降可能是由于氨基酸側鏈基團的氧化修飾程度高導致蛋白質構象的變化加劇，從而使蛋白質分子內疏水基團的暴露更多，表面疏水性不斷增加。同時由于游離巰基易氧化轉化為二硫鍵，導致蛋白質的出現大量聚集和沉淀[25]。

2.4 不同包裝方式對牛肉樣品肌間線蛋白的影響

肌間線蛋白是中間絲狀體結構的一個主要蛋白，其主要功能是維持肌細胞的結構和功能的完整性。肌間線蛋白的降解在宰后貯藏期間對肉質量的改善有重要的影響。不同包裝方式對宰后牛肉貯藏過程中肌間線蛋白降解的影響如圖4a、4b所示。

注：孔1、2、3代表貯藏0 d未包裝的牛肉樣品；孔4、5、6代表貯藏4 d后的托盤包裝、真空包裝、高氧氣調包裝的牛肉樣品；孔7、8、9代表貯藏7 d后的托盤包裝、真空包裝、高氧氣調包裝的牛肉樣品；孔10、11、12代表貯藏10 d后的托盤包裝、真空包裝、高氧氣調包裝的牛肉樣品。對照樣品為0 d的牛肉樣品。

由圖4b可知，不管是宰后貯藏4 、7 還是10 d，真空包裝牛肉樣品的肌間線蛋白降解率顯著高于托盤包裝和高氧氣調包裝的牛肉樣品（< 0.05），而在宰后貯藏4和7 d，托盤包裝牛肉樣品的肌間線蛋白降解率顯著高于高氧氣調包裝的牛肉樣品（< 0.05），在宰后貯藏10 d，托盤包裝牛肉樣品的肌間線蛋白降解率顯著低于高氧氣調包裝的牛肉樣品（< 0.05）。肌間線蛋白是一種含量豐富且非常重要的細胞骨架蛋白，它連接骨骼肌中肌節和肌膜的Z-盤，分子量約53 kDa，其主要功能是維持肌細胞結構和功能的完整性[26-27]。在宰后貯藏期間，肌間線蛋白的降解與鮮肉嫩度的改善密切相關[28]。在本研究中，3種包裝方式的肌間線蛋白降解不同，這可能是由于3種包裝的牛肉樣品的蛋白質氧化程度不同導致鈣激活酶活性抑制程度不同，從而使得活性不同的鈣激活酶在宰后貯藏期間對肌間線蛋白的降解程度有所差異。

2.5 不同包裝方式對牛肉樣品肌聯蛋白的影響

肌聯蛋白橫跨Z線和M線，維持肌纖維結構的完整性。宰后肌聯蛋白的降解速率和鮮肉嫩度密切相關。在宰后貯藏過程中，牛肉的肌聯蛋白由完整條帶降解為分子量大約2 400 kDa的降解產物。不同包裝方式對宰后牛肉貯藏過程中肌聯蛋白降解的影響如圖5所示。由圖5可知，在宰后貯藏0 d后，3種包裝方式下牛肉樣品的肌聯蛋白降解條帶T2沒有顯著差異（> 0.05）。無論宰后冷藏貯藏4 、7還是10 d后，真空包裝牛肉樣品的肌聯蛋白降解條帶T2顯著高于托盤包裝和高氧氣調包裝的牛肉樣品（< 0.05），即托盤包裝和高氧氣調包裝抑制了宰后牛肉肌聯蛋白的降解。肌聯蛋白是分子量很大的肌原纖維蛋白，約為2.8×106kDa，在有條紋的肌原纖維蛋白中，它橫跨Z線和M線，從而維持肌纖維骨架結構的完整性[29]。肌聯蛋白也是對降解最敏感的骨架蛋白之一，在宰后貯藏期間很容易降解，因此宰后貯藏過程中肌聯蛋白的降解速率和鮮肉嫩度密切相關[30]。試驗中，我們無論宰后貯藏4、7還是10 d，真空包裝牛肉樣品的肌聯蛋白降解率顯著高于托盤包裝和氣調包裝的牛肉樣品，說明包裝方式對肌聯蛋白的降解有顯著的影響。

注：T1表示完整的肌聯蛋白，T2表示降解的肌聯蛋白；孔1代表0 d的樣品并作為對照；孔2、3、4代表貯藏4 d后的托盤包裝、真空包裝、高氧氣調包裝的牛肉樣品；孔5、6、7代表貯藏7 d后的托盤包裝、真空包裝、高氧氣調包裝的牛肉樣品；孔8、9、10分別代表10 d后的托盤包裝、真空包裝、高氧氣調包裝的牛肉樣品。

3 結 論

相對于真空包裝，托盤包裝和高氧氣調包裝牛肉樣品在4℃貯藏10 d后其羰基在肌細胞分布不斷增加，說明羰基含量增加，蛋白質氧化程度加劇。宰后貯藏10 d后，托盤透氧包裝組和高氧氣調包裝組的蛋白質表面疏水性顯著高于真空包裝組（< 0.05）；宰后貯藏7 和10 d，托盤透氧包裝組和高氧氣調包裝組的肌間線蛋白和肌聯蛋白的降解顯著低于真空包裝組（< 0.05），說明托盤透氧包裝組和高氧氣調包裝組抑制了肌間線蛋白和肌聯蛋白的降解（< 0.05）。

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Effects of different packaging methods on protein oxidation and degradation of beef during refrigeration storage

Fu Qingquan1, Zhang Wangang2, Song Shangxin1, Wang Haiou1, Chen Shoujiang1

(1.211171,; 2.210095,)

Air packaging (AP), vacuum packaging (VP) and modified atmosphere packaging (MAP) have been widely used during chilled storage in retail meat market. However, different packaging has its advantage and disadvantage. AP can get desirable red color in a short time, but protein oxidation and lipid oxidation occur during cold storage. VP keeps a stable purple color and increases the shelf life of fresh meat. However, VP can cause liquid exudation and product deformation of fresh meat. MAP with 80% oxygen can maintain desirable and stable cherry red color of fresh meat and extend the shelf life of fresh beef. Nevertheless, it can possibly cause protein oxidation and lipid oxidation of fresh meat during chilled storage. Protein oxidation is the covalent modification of proteins induced by reactive oxygen species or by-products of oxidative stress. Previous researches have demonstrated that protein oxidation inhibits-calpain activity, which may influence the rate and degree of protein degradation of fresh meat. The aim of this study was to examine effects of AP and high-oxygen MAP (80% O2+ 20% CO2) on the tenderness of beef samples during postmortem cold storage using VP as control. Six longissimus dorsi muscles of Simmental purebred yellow cattle were precooled at 4℃ for 24 h, which were then randomly assigned to MAP, VP and AP, and stored for 0, 4, 7 and 10 d respectively at 4℃. The carbonyl content and distribution, the values of protein surface hydrophobicity, the solubility values of myofibrillar protein, sarcoplasmic protein and total protein, and the degradation of desmin and titin were determined, respectively. The results showed that AP and MAP presented the stronger fluorescence light signal in a peripheral area, and the fluorescence light signal spread to the internal cellular environment, which showed that the extent of protein oxidation increased. The values of protein surface hydrophobicity of beef samples from AP and MAP were significantly higher than that of the samples from VP (<0.05), while the protein solubility values of beef samples from AP and MAP were significantly lower than that of the samples from VP 10 d after the storage (<0.05). The degradation of desmin and titin of beef samples from AP and MAP was significantly lower compared to the VP 7 and 10 d after the storage (<0.05), which showed protein oxidation further inhibited the degradation of desmin and titin. Increased protein oxidation under AP and MAP inhibits the degradation of the key protein during postmortem cold storage.

refrigeration; packaging; protions; beef; air packaging; high oxygen modified atmosphere packaging; vacuum packaging; protein oxidation; protein degradation

10.11975/j.issn.1002-6819.2018.18.038

TS251. 5

A

1002-6819(2018)-18-0308-07

2018-05-03

2018-08-18

江蘇省科技廳自然科學青年基金項目（BK20170146）；江蘇省高校自然科學研究面上項目（17KJB550006）；南京曉莊學院高層次培育項目（2016NXY14）

扶慶權，博士，高級實驗師，研究方向為畜產品加工與質量控制。Email：fuqingquan@126.com

扶慶權，張萬剛，宋尚新，王海鷗，陳守江. 包裝方式對牛肉貯藏過程中蛋白質氧化及降解的影響[J]. 農業工程學報，2018，34(18)：308－314. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.18.038 http://www.tcsae.org

Fu Qingquan, Zhang Wangang, Song Shangxin, Wang Haiou, Chen Shoujiang.Effects of different packaging methods on protein oxidation and degradation of beef during refrigeration storage[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2018, 34(18): 308－314. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.18.038 http://www.tcsae.org