復(fù)凝聚法制備焦酚緩釋微囊工藝優(yōu)化

（河南師范大學水產(chǎn)學院，水產(chǎn)動物疾病控制河南省工程實驗室，河南省水產(chǎn)動物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng)453007）

我國淡水因水體富營養(yǎng)化和有害藍細菌水華造成的污染問題日益嚴重，導致生態(tài)環(huán)境失衡，已成為全球嚴重的環(huán)境問題之一[1]。目前，控藻的主要方法有物理、化學和生物法[2]。但這三類方法還存在一些不足之處，其中物理技術(shù)成本較高，化學技術(shù)生態(tài)安全性差，生物技術(shù)適用性不足等。

化感作用是指植物或微生物釋放代謝產(chǎn)物對環(huán)境中其他植物或微生物產(chǎn)生有利或不利影響[3]。胡利靜等[4]介紹了具化感作用的水生植物和陸生植物種類，并從細胞膜透性、光合作用以及細胞內(nèi)酶活性響應(yīng)三個方面闡述化感物質(zhì)抑藻的作用機理。沈冰潔等[5]從藻細胞光合作用、細胞膜的響應(yīng)等方面來探究植物化感抑藻機理，并比較分析了從水生植物和陸生植物中獲得的各種化感抑藻物質(zhì)的抑藻效果。馬來眼子菜、黑藻和苦草對藍藻具有顯著抑制作用，黃新穎等[6]對馬來眼子菜、黑藻和苦草三種沉水植物體內(nèi)抑藻活性物質(zhì)做了檢測分析。植物源活性物質(zhì)是一類來自植物機體的次生代謝產(chǎn)物，目前已篩選出的具有抑藻活性的植物源物質(zhì)以黃酮、酚酸和萜類等類別物質(zhì)為主[7]。Nakai等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)狐尾藻分泌的多酚化合物能抑制藍藻生長，并且進一步證明其中含有焦酚等多種物質(zhì)。劉碧云等[10]發(fā)現(xiàn)焦酚對銅綠微囊藻、水華魚腥藻等藻類的生長有不同程度影響，但在堿性條件或二價或三價金屬離子存在下，焦酚能進行自氧化?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的植物源活性抑藻物質(zhì)，生態(tài)安全性高，容易降解，但直接施用卻容易受復(fù)雜水環(huán)境影響出現(xiàn)局部濃度過高、有效成分流失、藥效持續(xù)時間短等問題。

緩釋劑是一種減緩藥物釋放速率從而延長藥效的制劑。緩釋常用的方法有微膠囊技術(shù)和化學鍵合等[11]。緩釋微囊的囊壁由高分子材料構(gòu)成，是通過多種方法將另一種物質(zhì)包含在內(nèi)而形成的具有控制囊內(nèi)物質(zhì)釋放過程的半透膜微膠囊[12]。海藻酸鹽、殼聚糖和明膠等是常用的天然高分子材料[13]。常用的微膠囊技術(shù)有流化床包埋法和凝聚法等[14]。其中復(fù)凝聚法是指使用兩種帶相反電荷的高分子材料作為囊壁，在一定條件下交聯(lián)且與囊芯物質(zhì)發(fā)生凝聚以形成微膠囊從而將囊芯物質(zhì)包覆[15]。

因此，本文采用殼聚糖-海藻酸鈉為囊材的復(fù)凝聚法制備焦酚緩釋控藻劑，并對制備工藝進行優(yōu)化，以期為高效生態(tài)安全的藻華防治技術(shù)提供思路。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑包括殼聚糖（粘度50-800 mPa.s）、海藻酸鈉 （粘度 （10g/L，20℃） /（Pa.s） ≥0.02）、焦酚、冰醋酸、二甲亞砜（DMSO）等。

主要儀器包括JTCQ系列固相萃取儀、DK-8D型電熱恒溫水槽、玻璃砂芯過濾裝置、真空干燥鍋、氮吹儀、5 mL注射器、培養(yǎng)皿、MS2-P1H磁力攪拌器、研缽、TG16-WS臺式高速離心機和多功能指數(shù)分析儀等。

1.2 焦酚緩釋微囊制備流程

首先，配制體積分數(shù)為1%的乙酸溶液，加入一定量殼聚糖，攪勻之后加入無水氯化鈣，在56℃水浴鍋中攪拌溶解至完全呈乳液，此溶液為體系1。其次，量取適量蒸餾水，添加海藻酸鈉，在56℃水浴鍋中攪拌溶解至粘稠狀，配制成海藻酸鈉溶液，根據(jù)囊芯濃度，相應(yīng)地稱取焦酚并量取DMSO，然后將焦酚-DMSO混合溶液與海藻酸鈉溶液混合，制成體系2。最后，將體系1的殼聚糖、冰醋酸和無水氯化鈣混合溶液配制好后，放在磁力攪拌器上，然后加入轉(zhuǎn)子，50℃600 rpm/min攪動，按體系2與體系1體積比為1∶10取體系2焦酚-DMSO-海藻酸鈉的混合溶液，用注射器逐滴滴加到體系1中，滴加完畢后再繼續(xù)攪動反應(yīng)30 min后將反應(yīng)后的微囊懸濁液過47 mm的微孔濾膜，然后轉(zhuǎn)移至干凈培養(yǎng)皿上，放入真空干燥鍋內(nèi)，在真空干燥鍋底部加入變色硅膠，然后抽真空，靜置在真空環(huán)境中讓其干燥。

1.3 微囊特性檢測

1.3.1 形態(tài)觀察

每一批微囊定量總體系體積、囊芯物質(zhì)質(zhì)量和微囊干重，相同容器、相同角度觀察每一種微囊形態(tài)。

1.3.2 殘留液內(nèi)焦酚含量的測定

在JTCQ系列固相萃取儀上插上萃取小柱，然后每個萃取柱按順序依次加入丙酮、甲醇和蒸餾水活化平衡，1 mL殘留液過柱后加蒸餾水淋洗，15 min抽干，然后加入丙酮洗脫，洗脫液放在氮吹儀上吹干，吹干后加入正己烷重懸浮，然后轉(zhuǎn)移到棕色GC進樣瓶中，BSTFA衍生化，GC分析。

1.3.3 緩釋微囊內(nèi)焦酚含量的測定

稱取5 mg微囊，放入研缽中研磨碎，加入丙酮對囊芯中的物質(zhì)進行浸提，超聲30 min，8000 rpm離心10 min，之后取上清濾液1 mL氮吹，吹干后正己烷重懸浮，轉(zhuǎn)移至1.5 mL GC進樣瓶，BSTFA衍生后GC分析，根據(jù)標線換算得到5 mg微囊內(nèi)焦酚質(zhì)量。

1.3.4 包埋率計算

包埋率=A/B×100%（A為微囊中焦酚實測含量，B為添加到微囊中的焦酚含量）

1.4 微囊制備工藝優(yōu)化

1.4.1 囊材最佳配比

配制海藻酸鈉溶液25 mL和殼聚糖溶液50 mL，兩者的質(zhì)量分數(shù)均為0.2%，在600 rpm/min 50℃條件下按比例將殼聚糖溶液加入到海藻酸鈉溶液中，用Tintometer Group多指數(shù)分析儀實時測定混合溶液電導率。考慮到殼聚糖溶液溶脹和不溶脹可能存在差異[16]，同時比較了殼聚糖溶脹12 h組和未溶脹組的囊材最佳配比。

1.4.2 不同囊芯濃度對微囊特性的影響

制備不同囊芯濃度的焦酚緩釋微囊，焦酚在體系2中濃度設(shè)置為1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL，比較不同濃度下微囊形態(tài)和包埋率，同時制作無囊芯的空白微囊作為對照。

1.4.3 不同含量助溶劑DMSO對微囊特性影響

設(shè)置最佳囊芯濃度和最佳囊材配比，制備不同DMSO含量（17%、29%、38%、44%、50%） 的焦酚緩釋微囊，詳細記錄制備過程、產(chǎn)品形態(tài)以及各體系的狀態(tài)等，等干燥后測定包埋率。

2 實驗結(jié)果

2.1 殼聚糖與海藻酸鈉最佳含量比

如圖1所示，不論殼聚糖是否溶脹，整個實驗反應(yīng)過程中電導率的變化趨勢基本一致。當殼聚糖與海藻酸鈉的比值0.5時，曲線發(fā)生轉(zhuǎn)折，這點說明溶液中所含離子量最少，也就是說，當比值為0.5時，正負電荷結(jié)合最充分，是復(fù)凝聚反應(yīng)的最佳比例。

圖1 溶液電導率隨殼聚糖與海藻酸鈉混合比例變化曲線Fig.1 The conductivity change curves of mixed solution of chitosan and sodium alginate at different proportions

2.2 不同焦酚添加量制備微囊特性比較

根據(jù)先前描述的微囊制備步驟，制備1-5 mg/mL的焦酚微囊，拍照記錄剛制備出的微囊形態(tài)，如圖2所示，1-3 mg/mL的微囊形態(tài)呈球形，4-5 mg/mL的微囊形態(tài)大部分呈球形，但大小不均勻。微囊干燥后稱重，1-3 mg/mL的微囊總干重較重，而4-5 mg/mL的微囊總干重相對較輕。由圖3的結(jié)果可以得出，不同囊芯濃度微囊的包埋率中，3 mg/mL和4 mg/mL微囊包埋率較高，其余囊芯濃度的微囊包埋率相對較低。綜合包埋率、微囊形態(tài)和微囊總干重三個指標可以得出，3 mg/mL為制作微囊的最佳濃度。

圖2 不同囊芯濃度焦酚微囊形態(tài)Fig.2 Form of pyrogallol microcapsules with different core concentrations

圖3 不同囊芯濃度微囊包埋率Fig.3 The embedding rate of pyrogallol microcapsules with different core concentrations

2.3 不同DMSO含量制備微囊特性比較

在微囊制備過程中發(fā)現(xiàn)DMSO含量對微囊形態(tài)會有影響，固定囊芯物質(zhì)濃度為3 mg/mL，設(shè)置一系列的DMSO含量梯度（17%、29%、38%、44%、50%），制備焦酚微囊，由圖4可見，不同DMSO含量的微囊都能成球形，DMSO含量升高，微囊色澤會變暗。由圖5可見，DMSO含量為17%和44%的微囊包埋率較高。當DMSO含量為29%和38%時，微囊的總干重較重，DMSO含量為17%、44%和50%時，微囊的總干重之間相差不大。綜合包埋率、微囊形態(tài)、微囊色澤以及微囊總干重等指標的結(jié)果，并從節(jié)約成本的角度考慮，我們認為17%為制作3 mg/mL微囊的DMSO最佳含量。

圖4 不同DMSO含量焦酚微囊形態(tài)Fig.4 Form of pyrogallol microcapsules with different DMSO content

圖5 不同DMSO含量焦酚微囊包埋率Fig.5 The embedding rate of pyrogallol microcapsules with different DMSO content

3 討論

倪利曉等[17]發(fā)明了以殼聚糖和海藻酸鈉為囊材，以亞油酸為囊芯的緩釋抑藻劑，在微囊制備工藝中添加乳化劑和交聯(lián)劑，并進行抑藻測試，實驗結(jié)果顯示，亞油酸緩釋抑藻劑對銅綠微囊藻具有明顯的抑制作用，但未對緩釋抑藻劑的包埋率進行檢測。黃皓旻等[18]發(fā)明了囊芯為黃酮，囊材為殼聚糖和海藻酸鈉，包埋率為50-70%的緩釋抑藻劑，在微囊制備過程中將pH調(diào)到最適并對制備的微囊進行常規(guī)藻類抑制實驗，發(fā)現(xiàn)緩釋微囊具有明顯的抑藻活性。本研究首次以沉水植物穗花狐尾藻化感物質(zhì)焦酚為囊芯，采用復(fù)凝聚法成功制備焦酚緩釋微囊，探究了囊材的最佳配比并從囊芯物質(zhì)濃度、助溶劑DMSO含量兩個方面優(yōu)化制備工藝，初步證明復(fù)凝聚法可以用于研發(fā)基于簡單酚類抑藻物質(zhì)的緩釋控藻制劑。

本文首先探究了囊材最佳配比，殼聚糖加入到海藻酸鈉溶液中后，海藻酸鈉的-COO-與殼聚糖上的-NH3+產(chǎn)生靜電作用，溶液中所含的帶電離子數(shù)量逐漸減少，曲線的拐點也即是最低點所對應(yīng)的比值為0.5，當比值大于0.5時，電導率又逐漸上升是因為在比值為0.5時殼聚糖與海藻酸鈉反應(yīng)完全，如果向溶液中再添加殼聚糖溶液就會使溶液中的殼聚糖含量過多，這時候測得的電導率就接近于殼聚糖溶液的電導率。綜上所述，殼聚糖與海藻酸鈉的復(fù)凝聚反應(yīng)最佳比例為1∶2。

實驗過程中還采用福林酚法檢測了反應(yīng)濾液中的總酚含量（未發(fā)表數(shù)據(jù)），較GC法測得焦酚含量高，暗示在制備焦酚緩釋微囊的過程中，焦酚仍發(fā)生了自氧化，導致一部分焦酚以自氧化產(chǎn)物的形式存在于濾液中。由此推測，緩釋微囊中囊芯物質(zhì)除了焦酚，也應(yīng)該有一部分自氧化產(chǎn)物。Nakai等（1999）的研究結(jié)果顯示，焦酚自氧化產(chǎn)物具有較強的抑藻效果[9]，那么，含有自氧化產(chǎn)物的焦酚緩釋微囊控藻效果如何，有待進一步研究。另外，因為殼聚糖和海藻酸鈉都帶有電荷，溶液的pH可能對反應(yīng)會有所影響，所以需要優(yōu)化復(fù)凝聚反應(yīng)的pH。