斑點叉尾鮰套腸癥溫和氣單胞菌的分離鑒定及藥敏研究

黃立新， 劉 熹

（1.鄭州市金水區農業農村工作委員會，河南鄭州 450000；2.河南省水產技術推廣站，河南鄭州450008）

斑點叉尾鮰（Ictalurus Punctatus） 屬于鯰形目鮰科，原產于美國，體形較長，體表光滑無鱗，背部呈淺灰色，腹部呈乳白色，身體兩側有不規則淺黑色小點，尾鰭分叉較深。頭部有觸須4對，有脂鰭，屬于廣溫性魚類。我國的斑點叉尾鮰是在1984年從美國引進的，經過后期的馴養和推廣，已在我國多個省、市、區廣泛養殖。隨著水產養殖業高密度、集約化養殖，養殖環境日益惡化，魚類細菌性疾病逐年增多，使水產養殖業的經濟損失嚴重。據報道，引起斑點叉尾鮰感染細菌性疾病主要有套腸癥[1]、腸道敗血癥[2]、暴發性敗血癥[3]、腹水病[4]等，斑點叉尾鮰套腸癥是較為嚴重的細菌性疾病，具有發病快、死亡率高的特點。近3年，我們對河南省內斑點叉尾鮰養殖區域進行流行病學調查，發現斑點叉尾鮰腸道疾病尤其是套腸癥發病嚴重。

本研究以發病典型的患病魚為實驗對象，對其病原菌進行分離鑒定，并研究致病菌對常用抗菌藥物的敏感性，為斑點叉尾鮰套腸癥的研究及防治提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

病樣為河南省鄭州滎陽養殖池塘的患病斑點叉尾鮰。健康斑點叉尾鮰，規格為：體長（16.5±10）cm，體重（39±5） g，取自湖北良種繁育基地，試驗前在消毒水簇箱內暫養一周，確認無病后用作后續試驗。

1.2 試劑

藥敏紙片購自杭州天和微生物技術有限公司，LB（Luria-Bertani）培養基和MH（Mueller-Hinton）培養基購自廣東環凱微生物科技有限公司，瓊脂粉購自北京索萊寶科技有限公司，API-20E為法國梅里埃公司生產。2×ES Taq Master Mix購自北京康為世紀生物科技有限公司。細菌DNA提取試劑盒均購自北京天根生物公司。

1.3 病原菌的分離培養

取發病典型癥狀的斑點叉尾鮰，在無菌條件下，從病魚肝、腎、脾和腹水等取樣，劃線接種于LB瓊脂培養基上，28℃培養24 h后，挑取形態一致的優勢菌進行純化養，將純化的菌株再轉接LB液體培養基中過夜培養，加25%的甘油-20℃保存備用。

1.4 攻毒試驗

挑純化的單菌落接種于LB液體培養基中，28℃恒溫培養18～20 h，離心棄上清，用無菌生理鹽水洗滌菌體，采用比濁法和細菌計數方法將菌懸液稀釋至1.0×108cfu/mL，依次十倍梯度稀釋至1.0×107cfu/mL、1.0×106cfu/mL、1.0×105cfu/mL、1.0×104cfu/mL。取暫養一周后的健康斑點叉尾鮰腹腔注射菌懸液，每組注射10尾，注射量為每尾0.2 mL，空白對照組注射0.2 mL的無菌生理鹽水。在24～30℃水溫下飼養，連續觀察15 d，記錄魚的死亡數量及發病癥狀。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 API-20E生化鑒定

采用API-20E細菌鑒定系統，按照鑒定系統對應的產品說明書對病原菌進行生化鑒定。同時進行接觸酶、氧化酶、V-P和葡萄糖氧化發酵試驗。

1.5.2 16S rRNA基因分子鑒定

將菌株接種于5 mL的LB液體培養基中，以28℃、180 rpm振蕩培養12 h，12000 rpm離心3 min棄上清獲取菌體。按照DNA試劑盒說明書提取細菌DNA，-20℃保存。采用16S rRNA基因[5]進行PCR 擴 增 ： F∶5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，R∶5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'，反應體系(20μL)：2×ES Taq Master Mix 10μL，上下游引物各 0.8μL，DNA模板 1μL，用雙蒸水補足至20μL。反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火60 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃終延伸10min。

1.6 藥敏試驗

蘸取純化的細菌培養物于LB液體培養基中過夜培養，將生長至對數生長期的菌液調至0.5麥氏比濁管濃度，吸100ul均勻涂布于MH平板上，等距離貼上藥敏紙片，28℃恒溫培養24 h，測量抑菌圈直徑的大小，根據藥敏紙片說明書判定耐藥（R）、敏感（S）或中度敏感（I）。

2 結果

2.1 患病魚臨床癥狀

患病斑點叉尾鮰游動緩慢、食欲減退，體表充血、出血并出現大小不等的脫色斑；肛門外突、發紅，后腸段的一部分脫出到肛門外，腹部膨大；腹腔內有淡黃色腹水，腸道中后段出現腸套疊，肝臟腫大，顏色變淡發白或呈土黃色。患魚的肝臟出現出血斑，質地變脆，脾、腎出現腫大現象。

2.2 細菌形態

從患典型套腸癥的斑點叉尾鮰肝臟中分離到一株優勢菌，暫命名為ZX-1。菌株ZX-1在LB瓊脂培養基上，呈現圓形、表面濕潤、中央微凸、邊緣光滑整齊的單菌落，革蘭氏染色陰性、短桿狀，直徑在 1～2.5mm。

2.3 攻毒試驗結果

采取腹腔注射的方式進行攻毒試驗。結果表明，ZX-1對斑點叉尾鮰有強致病力，采用改良的寇氏法計算菌株的半致死劑量 LD50為3.91×105cfu/mL。發病魚病癥與自然發病魚癥狀一致，主要表現為體表充血、出血，肛門紅腫、外突，腹腔內有淡黃色腹水，腸道中后段出現腸套疊，肝臟腫大，顏色變淡發白。另外從攻毒感染發病的魚體中重新分離到的菌株經生化鑒定和分子鑒定表明其與感染用的ZX-1一致，由此可證明該菌株為此次斑點叉尾鮰套腸癥的病原菌。

表1 ZX-1 菌株對斑點叉尾鮰攻毒感染試驗結果Tab.1 Results of Ictalurus Punctatus infected with strain ZX-1

2.4 菌種鑒定

2.4.1 API-20E生化鑒定

ZX-1菌株的氧化酶陽性，可發酵葡萄糖，不產生H2S，硝酸鉀、吲哚、色氨酸、檸檬酸、精氨酸、N-乙酰-葡萄糖胺、甘露糖和V-P試驗等陽性，鳥氨酸脫羧酶、脲酶、色氨酸脫羧酶、已二酸、肌醇、山梨醇、密二糖、阿拉伯糖、苦杏仁甙試驗均為陰性。API-20E系統鑒定結果見表2。

2.4.2 16S rRNA基因鑒定

PCR擴增ZX-1菌株的16S rRNA基因片段約1500 bp，測序結果表明該片段有 1487 bp，在GenBank中的登陸序列號為AB473013。同源性檢索結果表明ZX-1菌株與氣單胞菌屬的溫和氣單胞菌核苷酸同源性達99%以上。從NCBI核酸數據庫中選取同源性較高的同源性序列，利用MEGA6.0軟件建立進化樹（圖1）。ZX-1與溫和氣單胞菌菌株AB473013聚成一個分支。

表2 ZX-1菌株的API-20E鑒定結果Tab.2 The identification of strain ZX-1byAPI-20E

圖1 ZX-1菌株16S rRNA基因序列進化樹Fig.1 The phylogenetic tree of strain ZX-1 based on 16S rRNA sequence

2.5 藥敏試驗

ZX-1菌株對16種抗菌藥物敏感性研究表明，該菌株對氟喹諾酮類藥物如氧氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星敏感，另外對氯霉素、氟苯尼考和復方新諾明敏感；對青霉素、阿莫西林、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、利福平、四環素耐藥。

表3 ZX-1菌株對16種抗菌藥物的藥敏試驗Tab.3 Antibiotic sensitivity test of 16 antimicrobial drugs against ZX-1

3 討論

斑點叉尾鮰是中國主要的淡水經濟魚類，因此肉質上乘、營養豐富等特點受到廣大養殖戶的青睞。目前，斑點叉尾鮰的細菌性病原菌已報道的有氣單胞菌（Aeromonas）、假單胞菌（Pseudomonas）和嗜麥芽寡養單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）等[6]，溫和氣單胞菌可引起多種魚類患腸道疾病[4]，快速又準確地鑒定出魚類的這些致病菌，并采取及時有效的防控和治療措施，對減少水產養殖業的經濟損失具有重大意義。

本研究采用快速診斷細菌性疾病的API-20E生化系統進行鑒定，結果顯示菌株ZX-1可發酵葡萄糖，不產生H2S，利用硝酸鉀、色氨酸、精氨酸、甘露糖等，不利用阿拉伯糖、肌醇、山梨醇等的理化反應與彭亞等[4]的結果一致。但其鼠李糖陽性、山梨醇陰性、阿拉伯糖陰性反應與樊海平等[7]的研究結果不一致。說明相同菌株、理化性質不同，可能與其宿主和其分布的地域等有關。16S rRNA基因作為細菌分類鑒定的分子學方法具有操作簡便、靈敏度高、準確性好的特點，故其序列比對已成為首選的分子學技術。本研究中ZX-1的16S rRNA序列與GenBank中的溫和氣單胞菌AB473013的同源性達99%，并且該菌株與溫和氣單胞菌AB473013在進化樹上聚為一支。根據王海娟等[5]的研究，當細菌的16S rRNA基因同源性在99%以上時，可被認為屬于同一種。本研究同時采用傳統微生物鑒定和分子鑒定兩種方法，從而準確地從發病斑點叉尾鮰中分離鑒定出了溫和氣單胞菌。

攻毒試驗表明，從瀕死斑點叉尾鮰中分離到的菌株ZX-1可感染健康斑點叉尾鮰，并對斑點叉尾鮰有較強的致病和致死作用，且發病癥狀一致，均表現出體表充血、出血，肛門紅腫、外突，腹腔內有淡黃色腹水，腸道中后段出現腸套疊，肝臟腫大、顏色變淡發白等癥狀。從攻毒患病斑點叉尾鮰中分離的細菌經鑒定與ZX-1菌株的生理生化鑒定和分子鑒定結果一致，證明ZX-1為斑點叉尾鮰患套腸癥的致病菌。

水產動物養殖過程中常選用抗菌藥物對細菌感染進行防治，但是過多使用抗菌藥物將導致菌株產生耐藥性。經16種抗菌類藥物對分離菌的藥敏試驗，結果顯示該菌對喹諾酮類敏感，對氯霉素、氟苯尼考和復方新諾明也敏感；對氨基糖苷類、青霉素類、利福平和四環素耐藥。曹海鵬等[8]研究表明，金魚（Carassius auratus） 源溫和氣單胞菌對慶大霉素、環丙沙星等高度敏感，對新生霉素、氨芐青霉素等均不敏感，與本文研究結果存在差異。劉洋等[9]分離的細鱗魚（Brachymystax lenok） 源溫和氣單胞菌對四環素、慶大霉素、環丙沙星、氧氟沙星等高度敏感，對氯霉素、復方新諾明中度敏感，對紅霉素耐藥，與本文研究結果存在差異。所以相同菌種但不同來源的菌株的耐藥性因宿主或地理環境的不同而存在差異性。根據本研究結果，應及時控制當地對β-內酰胺類、四環素類和氨基糖苷類藥物的使用。本研究可為進一步研究溫和氣單胞菌的耐藥機制、監測水產養殖環境和魚體中細菌的耐藥性提供參考。