金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌混合感染引發的腦膜炎

殷鑫歡，楊曉宇，徐 雷，魯令華，曾喻兵，徐志文，2，朱 玲，2

（1.四川農業大學動物醫學院，四川 成都 611130；2.四川農業大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130）

金黃色葡萄球菌廣泛分布于自然界，同時也存在于人和動物的體表、鼻腔、消化道等部位，是一類條件性致病菌。金黃色葡萄球菌可引起人和動物各種急、慢性感染，包括尿道炎、脊髓炎、心肌炎、肺炎、腦膜炎、腸炎、乳腺炎、敗血癥等。該菌在侵入機體后分泌多種毒力因子，如溶血素、殺白細胞毒素，前者可破壞紅細胞和血小板，造成局部缺血壞死，后者可導致T細胞、嗜中性粒細胞、自然殺傷細胞、單核細胞、巨噬細胞等免疫細胞受損甚至裂解從而影響正常宿主的免疫功能[1]。在動物中，金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的最常見病原之一[2]，過去人們常用甲氧西林和萬古霉素等抗生素治療金黃色葡萄球菌感染[3]，但隨著抗生素的廣泛使用，已經出現了大量的耐藥菌株[4-5]。中國細菌耐藥監測報告顯示，2016年臨床上共檢測出金黃色葡萄球菌265 716株，占檢出的革蘭氏陽性菌的32.3%，位列革蘭氏陽性菌首列，其中耐甲氧西林的全國平均檢出率高達34.4%。

豬鏈球菌是一種人獸共患的急性、熱性傳染病，屬于國家規定的二類動物疫病。在我國，豬鏈球菌病已經成為主要的細菌性疾病，該病表現出急性出血性敗血癥、心內膜炎、腦膜炎、關節炎、哺乳仔豬下痢和孕豬流產等[6]。根據莢膜抗原的不同，將其分為35個血清型，其中1型、2型、1/2型、7型、9型、14型是引起豬鏈球菌病的主要血清型，豬鏈球菌2型流行最廣，對豬的致病性亦最強，且能引起人的發病死亡，嚴重威脅著公共衛生安全[7]。豬群之間可以通過密切接觸或者氣溶膠的形式傳播感染，病原菌通過呼吸道、生殖道和消化道感染，也可經皮膚黏膜創傷感染。

2018年7月四川省樂山市一規模化豬場的保育豬只出現大面積發病，外觀表現為豬只關節腫脹，四肢滑行等神經癥狀。解剖發現關節、心包積液、大腦腦膜充血出血，實驗室通過選擇大腦腦膜、關節液、心包液涂板進行細菌學檢測，同時對豬藍耳病病毒、豬偽狂犬病病毒分別進行了RT-PCR和PCR檢測，結果表明該豬場不存在這兩種病毒感染，而在大腦、心包積液、關節積液中均分離到了兩種不同形態的細菌，現將檢測結果介紹如下。

1 材料與方法

1.1 病料采集

病料采集于2018年7月，來自四川省樂山市一規模化豬場發病豬只的大腦、關節液、心包液。

1.2 主要試劑與動物

胰蛋白胨、酵母粉、大豆蛋白胨、磷酸氫二鉀、瓊脂粉、無水葡萄糖、氯化鈉、丙三醇購自瑞金特公司，犢牛血清購自 BBI公司，DL 2 000 Marker、2 Taq PCR Master Mix、ddH2O購自寶生物公司，SPF級昆明鼠購自成都達碩實驗動物有限公司，細菌基因組提取試劑盒購自TIANGEN公司。

1.3 細菌的分離和純化

無菌采集病豬的關節積液、腦膜分別接種TSA平板劃線，培養皿置于37℃細菌培養箱培養24 h，觀察菌落形態。將疑似菌落繼續挑單擴大，然后進行革蘭氏染色觀察細菌形態。將擴大的單一形態的細菌接種TSB肉湯純培養，37℃、170 r/min培養過夜后取菌液與50%的甘油等體積混合保種，置于-20℃。

1.4 動物試驗

動物試驗分為兩組，每小組選取4只成年系SPF昆明小鼠，第1組選取兩只小鼠注射金黃色葡萄球菌，另外兩只注射鏈球菌，第2組全部注射生理鹽水。挑取單菌落37°C、170 r/min振蕩培養過夜，4°C、5 000 r/min離心5 min收集菌體，用無菌生理鹽水懸浮菌體，按 0.2 mL/只（6×108CFU/mL）劑量腹腔注射，對照組注射等量生理鹽水。觀察并記錄小鼠狀態和死亡情況，剖檢死亡小鼠并分離細菌。

1.5 細菌16S rDNA基因的擴增

應用實驗室檢測細菌的16S rDNA引物擴增細菌的16S rDNA基因，預期擴增長度為1 465 bp，反應體系（30 μL）：上、下游引物各 0.5 μL（20 μmol/L），細菌基因組 2 μL（320 ng/μL），2×Taq PCR Master Mix 15 μL，ddH2O 12 μL。反應條件：95 °C 5 min；95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 45 s，30 個循環；72°C 7 min，將PCR產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察到相應的條帶后將PCR產物送至上海生工生物工程公司進行測序，引物序列如表1。

表1 試驗中使用到的引物

1.6 藥敏試驗

藥敏試驗參照CLSI[8]標準采用紙片擴散法，選擇對革蘭氏陽性菌效果偏好的藥物進行藥敏試驗，對金黃色葡萄球菌和鏈球菌各選取14種藥物，每組做3個平行對照。選取搖過夜的菌液各150 μL用三角棒均勻涂抹于TSA平板上，靜置2 min后用無菌鑷子夾取藥敏紙片貼于平板表面，37°C培養24 h后，測量各種藥敏紙片的抑菌圈直徑并判定藥敏結果。

2 結果

2.1 細菌的分離培養及鏡檢

在12～18 h的培養過后，TSA平板上長出了黃色、凸起濕潤的中等大小菌落和淺白色、針尖大小的小菌落。經過革蘭氏染色觀察發現，黃色的菌落染色形態為聚堆狀的圓形球菌，較小的菌落染色形態為成對或者短鏈存在的球菌（圖1）。

圖1 細菌的革蘭氏染色

2.2 細菌致病性試驗

第1組注射金黃色葡萄球菌和鏈球菌的4只小鼠精神萎靡，被毛凌亂，呼吸急促呈現腹式呼吸，雙眼緊閉，并且分別在18 h內死亡，而對照組的4只小鼠沒有什么明顯變化。通過解剖發現，注射兩種金黃色葡萄球菌的小鼠腸道出血變紅，肝臟邊緣出血，肺臟出血。注射鏈球菌的小鼠肺臟和肝臟邊緣均有出血，腸道積聚膠凍樣物質。

2.3 細菌16S rDNA擴增

根據16SrDNA基因引物序列擴增出相應1465bp的片段大小（圖2）。將擴增產物送至生工生物公司測序獲得結果。用DNASTAR軟件進行拼接，然后在NCBI上進行比對，結果顯示分別是金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌，且同源性分別達到99%，綜合分析分離菌落形態特征和16S rDNA基因序列分析結果，證實分離到1株金黃色葡萄球菌和1株豬鏈球菌。

圖2 細菌16S rDNA擴增結果

2.4 藥物敏感試驗

藥敏試驗結果如表2和表3，分別選用13種抗生素對兩種菌做藥敏試驗，結果顯示金黃色葡萄球菌對頭孢唑肟、紅霉素、頭孢哌酮、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢他啶高度敏感，對氟苯尼考、恩諾沙星中度敏感，對四環素、阿莫西林、氨芐西林耐藥；鏈球菌對頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢唑肟、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢他啶高度敏感，對恩諾沙星中度敏感，對多西環素、氨芐西林、青霉素、氟苯尼考、四環素、紅霉素耐藥。

表2 金黃色葡萄球菌藥物敏感性結果

表3 鏈球菌藥物敏感性結果

3 討論

夏季是很多細菌性疾病多發的時節，通過近期實驗室檢測發現，豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌易與豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染，引發豬只的呼吸系統疾病，同時伴有關節積液、腦膜充血、出血等表現。

由藥敏試驗結果得知，分離到的該株金黃色葡萄球菌對頭孢唑肟、紅霉素、頭孢哌酮、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢他啶高度敏感，而對四環素、阿莫西林、氨芐西林耐藥；鏈球菌對頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢唑肟、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢他啶高度敏感，對多西環素、氨芐西林、青霉素、氟苯尼考、四環素、紅霉素耐藥。證明常規的頭孢藥物對于這兩種菌的效果比較好，結合之前的實驗室檢測數據證實頭孢唑林對這兩種菌的效果都較好，且屬于低代次的頭孢類藥物，在臨床防控中應該避免直接就使用頭孢三四代藥物，這樣容易導致細菌的耐藥程度提高，不利于之后疾病的防控。