中草藥熏香燃煙體外抑菌試驗

陶 劍，馮磊磊，張德隆，孟 立，衛(wèi)恒習(xí)，李 莉，張守全

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心/廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點實驗室，廣東 廣州 510642；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

近年來我國的養(yǎng)豬業(yè)高速發(fā)展，養(yǎng)殖的主要方式已經(jīng)從傳統(tǒng)粗放型的散養(yǎng)模式向集約化、規(guī)模化、標準化、專業(yè)化方向轉(zhuǎn)變。而規(guī)模化養(yǎng)殖場常年不斷發(fā)生細菌病，細菌的混合感染或者繼發(fā)性感染是導(dǎo)致豬群的發(fā)病率和死亡率增高的重要原因[1]。細菌病的傳播多為通過空氣傳播，殺滅空氣和欄舍表面的細菌可有效防治豬病。中藥熏香是操作簡單、消毒效果好并且經(jīng)濟實惠的有效途徑之一。在我國，中藥熏香療法具有悠久的歷史并被廣泛的應(yīng)用于臨床，防治多種疾病[2]。熏香經(jīng)燃燒后產(chǎn)生微粒性煙塵，經(jīng)呼吸道或者皮膚吸入等方式進入體內(nèi)發(fā)揮藥效，達到消毒殺菌、增強身體免疫力、促進體內(nèi)調(diào)和能力、驅(qū)蟲滅蚊等作用[3-4]。有研究表明，中草藥熏香劑可以調(diào)節(jié)大鼠免疫器官、全血T細胞亞群及肺泡灌洗液中 IFN（干擾素）-γ 水平[5]，提高血清 sIgA、IL（白細胞介素）-6水平[6]，增強免疫力。本試驗研究了中草藥熏香燃煙及其溶解物抑制金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、嗜水氣單胞菌的活性，為利用中草藥熏香防控豬病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2017年6—8月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心/廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點實驗室進行。

1.2 材料

中草藥熏香由廣東天地本草飼料科技股份有限公司提供，其主要成分包括艾草、蒼術(shù)、五倍子、芡實、玉竹等10數(shù)種中草藥。標準菌株：金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、沙門氏菌。M-H培養(yǎng)基購置于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，定性濾紙購置于杭州沃華濾紙有限公司，100 mm培養(yǎng)皿、0.45 μm、0.22 μm 過濾器等均購置于廣州佳妍生物有限公司。

1.3 中草藥熏香燃煙提取物

準確稱量熏香，以3倍的超純水或75%乙醇溶解燃煙。以1 g熏香完全燃盡通過溶解裝置并溶解于1 mL相應(yīng)的溶劑作為熏香1 g/mL的生藥濃度。點燃熏香，放入大錐形瓶中，泵入空氣通過集氣瓶洗氣裝置溶解煙霧，合并3個集氣瓶的溶液，60℃烘箱濃縮成熏香生藥濃度10 g/mL的溶液。分別用超純水和75%乙醇吸收濃縮得到水溶解物和乙醇溶解物，水溶解物烘干后用二甲基亞砜（DMSO）溶解得到DMSO溶解物，乙醇溶解物干燥除去乙醇后用DMSO重溶解得到乙醇-DMSO溶解物；0.22 μm過濾除菌后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 藥敏試紙

用6 mm打孔器將定性濾紙打成6 mm圓形紙片，高溫高壓滅菌，烘干。在超凈臺中用移液槍吸取2.5 μL的提取液滴加到無菌濾紙片上，自然風(fēng)干，重復(fù)10次得到藥敏試紙，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 菌液制備

在超凈工作臺中將金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、嗜水氣單胞菌接種到LB瓊脂培養(yǎng)基平板上，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h，挑取單克隆接種到無菌LB培養(yǎng)基中200 r/min、37℃搖菌6～8 h，然后用LB培養(yǎng)基配置成0.5麥氏比濁濃度（相當(dāng)于1.5×108cfu/mL細菌濃度），再稀釋成1.0×106cfu/mL的菌液作初篩和測定最小抑菌濃度（MIC）用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.6 濾紙片法測定抑菌圈直徑

在超凈工作臺上將高溫高壓滅菌后的M-H瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿15～20 mL。待冷卻凝固后，吸取200 μL稀釋10倍的菌液（相當(dāng)于1.5×107cfu/mL）滴加到平皿上并均勻涂布。再用無菌鑷子夾取各藥敏試紙放到含菌培養(yǎng)基表面、37℃培養(yǎng)48 h，每組重復(fù)3次。用游標卡尺測量抑菌圈的直徑，重復(fù)測量3次。

1.7 最小抑菌濃度MIC的確定

取無菌96孔板，每排加入100 μL培養(yǎng)基，然后在第2孔加入100 μL提取液，充分混勻后取出100 μL移至第3孔中，以此類推倍比稀釋至第11孔，混勻后棄掉100 μL。每排第1孔至加培養(yǎng)基作為陰性對照，第2孔起加入100 μL菌液（濃度1.0×106cfu/mL），第12孔不加提取液作為陽性對照，37℃培養(yǎng)18 h后觀察，以培養(yǎng)基清澈的最低濃度為抑菌濃度。

1.8 菌落計數(shù)法模擬現(xiàn)場殺菌作用

在超凈工作臺中用LB培養(yǎng)基將0.5麥氏比濁濃度的菌液（相當(dāng)于1.5×108cfu/mL細菌濃度）稀釋105倍，吸取100 μL菌液均勻涂布在100 mm無菌M-H瓊脂培養(yǎng)基上。在超凈工作臺中點燃中草藥熏香，待產(chǎn)生均勻穩(wěn)定的煙霧后，將涂布好的平板開蓋倒扣在煙霧上方約30 cm處，分別停留0 min、1 min、5 min、10 min、30 min、60 min，結(jié)束后 37 ℃培養(yǎng) 12 h，每組重復(fù)3次，觀察記錄不同時間的菌斑數(shù)。

1.9 統(tǒng)計分析

用SPSS Statistics 19.0軟件中的單因素方差分析進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準誤表示，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 熏香燃煙水溶解物和不同溶解物的抑菌圈結(jié)果

熏香燃煙不同溶解物對5種菌的抑菌大小如表1所示。其中，乙醇-DMSO溶解物對5種菌的抑菌圈直徑最大，抑菌效果最好，對大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑分別為（11.95±0.40）mm、（7.19±0.08）mm、（7.13±0.13）mm、（8.78±0.26）mm、（12.54±0.19）mm；而水-DMSO溶解物對大腸桿菌和嗜水氣單胞菌的效果次之，水溶解物抑菌圈直徑最小。而對于沙門氏菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌，水溶解物的抑菌圈直徑則大于水-DMSO溶解物。

表1 熏香燃煙不同溶解物對5種細菌抑菌圈直徑的初篩結(jié)果 mm

2.2 熏香燃煙水溶解物和不同溶解物對細菌的MIC

采用微量稀釋法分別測定熏香不同溶解物對5種細菌的MIC，結(jié)果如表2所示。乙醇-DMSO溶解物對5種細菌最為敏感，抑菌濃度最低，其次為水-DMSO溶解物，最次水溶解物。各溶解物對金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果最好，尤以乙醇-DMSO溶解物的MIC最小，分別為39.1 mg/mL和78.1 mg/mL。

表2 熏香燃煙不同溶解物對5種細菌的MIC mg/mL

2.3 熏香對不同細菌模擬現(xiàn)場殺菌作用

熏香經(jīng)模擬現(xiàn)場殺菌試驗測試，結(jié)果如表3、表4所示，經(jīng)過10～30 min的煙熏，可以完全殺滅涂布在平板上的5種細菌。其中以對嗜水氣單胞菌的效果最好，煙熏1 min的滅菌率為（29±1）%，煙熏5 min之后已能全部殺滅；其次為鏈球菌和大腸桿菌，煙熏10 min后平板上分別還有（6.33±4.10）cfu和（7.33±0.33）cfu，滅菌率分別為（94±4）%和（97±0）%。而對金黃色葡萄糖球菌和沙門氏菌則需要更長時間的煙熏才能達到殺菌作用。

表3 熏香對不同細菌模擬現(xiàn)場殺菌作用

表4 熏香對不同細菌模擬現(xiàn)場的殺菌率

3 討論

現(xiàn)代養(yǎng)殖場是疾病的重災(zāi)區(qū)和細菌污染源，疾病的防治是養(yǎng)殖場的重要環(huán)節(jié)。殺滅空氣中病菌是防治疾病的有效手段之一。豬場內(nèi)常用的殺菌方式有化學(xué)消毒劑殺菌和物理方式殺菌，然而常規(guī)的化學(xué)消毒劑消毒均存在不同的毒性[7]，對豬群和人員有一定的副作用，而物理殺菌方式主要是紫外線燈殺菌，此法易引起皮膚紅斑、刺激眼結(jié)膜[8]，并且紫外線穿透力小，存在殺菌盲區(qū)，消毒不徹底。中草藥熏香源于野生植物，具有很高的安全性[9]，燃燒產(chǎn)生煙氣可以散發(fā)到整個空間，殺菌驅(qū)蚊徹底無死角，甚至在不關(guān)閉門窗時也能達到良好的效果，所產(chǎn)生的芳香性煙霧對皮膚、黏膜以及呼吸道無刺激，同時能達到止咳平喘、預(yù)防流行性感冒、增強免疫力等功效[8]。

艾草中含有桉油素、β-石竹烯、α-萜品烯醇以及芳樟醇等有效活性物質(zhì)，因此具有殺滅螨蟲、驅(qū)除蚊子、蒼蠅、蟑螂、螞蟻等功效以及對大腸桿菌、變形桿菌、腸炎膜桿菌、葡萄球菌、釀酒酵母菌、白色念球菌、黑曲霉菌等有很好的抗菌活性。姚勇芳等[10]研究表明，艾草的水提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有較好的抑菌效果，而對霉菌抑制效果不明顯。陳羽等[11]發(fā)現(xiàn)艾葉提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白假絲酵母菌和黑曲霉均起到了顯著的殺菌作用。劉巍等[12]考察了艾葉水提液對常見婦科致病菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)艾葉水提液對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等5種常見致病菌均有明顯的抑制作用。尹璐等[13]研究表明，蒼術(shù)具有廣譜抗菌作用，對大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌等4種菌均具有較好的抑制作用。張霞等[14]研究表明，五倍子對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有有效的抑菌效果，其浸出物的最小抑菌濃度分別為12.5 mg/mL和6.25 mg/mL，并且50 mg/mL的五倍子浸提物的抑菌效果相當(dāng)于2.5 mg/mL的青霉素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，可能是其中含有鞣酸的緣故。

本試驗研究了熏香燃煙及燃煙溶解物對5種常見細菌的抑制作用，結(jié)果表明該熏香燃煙對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、嗜水氣單胞菌都有一定的抑制作用，而對金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌的抑制作用較好，可能是因為其中的艾草含有的抑菌物質(zhì)對其有較好的抑制作用，這與盧學(xué)根的研究結(jié)果相近[10]。但抑菌圈直徑較小，最大抑菌圈直徑也僅有12.5 mm，MIC試驗也表明需要較高的濃度才能達到抑菌作用。可能是因為熏香中抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性較差[15]，經(jīng)過燃燒后產(chǎn)生的燃煙中有效成分含量較低或者被水或乙醇的吸收量較少，導(dǎo)致有效成分的濃度較低的緣故。

4 結(jié)論

熏香燃煙的乙醇-DMSO溶解物的抑菌效果最好，尤其是對嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌的敏感程度較高，其次為水-DMSO溶解物，最次為水提取物。而直接用熏香燃煙熏10～30 min后都可以達到很好的熏滅效果，尤其對嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、鏈球菌的熏滅效果最佳。