補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方對胰腺癌模型小鼠腫瘤高甲基化基因1、沉默信息調(diào)節(jié)因子、Shh蛋白濃度的影響

蘇全武,胡 波

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院,湖北省隨州市中心醫(yī)院 感染科,湖北 隨州,441300;2.湖北省鄂州市中醫(yī)醫(yī)院 普外科,湖北 鄂州,436000)

近年來，胰腺癌的發(fā)病率日益增高，是惡性程度較高的腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前仍缺乏有效的治療手段[1-2]。現(xiàn)代研究[3]顯示，腫瘤高甲基化基因1(HIC1)可以和沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT1)形成復(fù)合物，與SIRT1啟動子結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄，故HIC1與SIRT1構(gòu)成了一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在惡性腫瘤的發(fā)病過程中扮演著重要角色。有研究[4]顯示，中藥通過補(bǔ)氣通絡(luò)解毒可上調(diào)模型小鼠HIC1基因表達(dá)，下調(diào)SIRT1基因表達(dá)，從而使HIC1、SIRT1信號通路恢復(fù)平衡，發(fā)揮治療胰腺癌的微觀分子生物學(xué)效應(yīng)。作者[5]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方含藥血清對人BbPG3胰腺癌細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。

Shh(Hh信號通路的重要組成部分)信號通道可以在很多種組織的干細(xì)胞維持和調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，而其中的很多分子已被作為癌基因或抑癌基因所認(rèn)識[6],推測Shh信號途徑在促使干細(xì)胞向腫瘤干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中可能具有很多關(guān)聯(lián)。有資料[7]顯示胰腺癌的發(fā)生及其惡性生物學(xué)特性的維持與Hh信號通路的過度激活密切相關(guān)。研究[8]報道Shh信號通路異常和胰腺癌的產(chǎn)生及惡化具有一定相關(guān)性，其可能作用機(jī)制如下: ① Shh可調(diào)控細(xì)胞周期介導(dǎo)蛋白因子P21及cyclin D1的細(xì)胞復(fù)制、增殖及生長功能，導(dǎo)致胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞生成及生長;② Shh能夠增強(qiáng)PI3k/Akt信號通路活性，使得細(xì)胞內(nèi)抗凋亡因子Bcl-XL和Bcl-2處于高表達(dá)狀態(tài)，導(dǎo)致該類細(xì)胞癌變后能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤逃逸。

作者根據(jù)導(dǎo)師邱明義教授有關(guān)“臟虛絡(luò)痹毒結(jié)”的腫瘤病因病機(jī)理論[9]，結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗(yàn)自擬補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方治療胰腺癌，取得了較好的臨床療效。作者使用補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方作用于實(shí)驗(yàn)性胰腺癌模型小鼠，觀察其對HIC1、SIRT1、Shh蛋白濃度的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料及方法

1.1 材料

雄性裸小鼠SPF級(BALB/C)30只,7～8周齡，體質(zhì)量(22.00±3.00) g,由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院中南醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。人胰腺癌細(xì)胞系SUIT-2由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院腫瘤研究中心提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

人胰腺癌細(xì)胞SUIT-2復(fù)蘇后，加入含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37.5 ℃、5% CO2飽和度的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 動物模型的建立

在實(shí)驗(yàn)前觀察2周，若裸小鼠生長正常(死亡率不超過12%),分別在造模組裸小鼠左后腿外側(cè)皮內(nèi)注射SUIT-2細(xì)胞1×105個，隨后建立移植瘤模型;空白組(n=10)則于左后腿外側(cè)皮內(nèi)注射同體積生理鹽水。造模成功后將造模組隨機(jī)分為模型組和治療組各10只。

1.4 藥物補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方的制備

補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方組方如下: 柴胡9 g,枳殼15 g,川芎10 g,地龍10 g,人參105 g,黃芪15 g,蜈蚣4 g,莪術(shù)15 g,龍葵15 g,炙甘草9 g等。劑量按成人標(biāo)準(zhǔn)劑量換算為小鼠劑量，即50 g/(kg·d)生藥。使用冷水浸泡藥材20 min,隨后用武火煎至水沸，再改用文火煎煮30 min,濾出藥液后再加冷水300 mL,再次煎至水沸，用文火煎煮30 min,再次濾出藥渣，將2次的藥液混勻后濃縮為含生藥2.5 g/mL的藥液，藥液放置于0～6 ℃冰箱保存。

1.5 給藥劑量與方法

空白組: 按25 mL/kg體質(zhì)量給予生理鹽水灌胃,1次/d,連續(xù)14 d。模型組: 移植癌細(xì)胞至肉眼可見移植瘤時，按25 mL/kg體質(zhì)量給予生理鹽水灌胃,1次/d,連續(xù)14 d。治療組: 移植癌細(xì)胞至肉眼可見移植瘤時，按25 mL/kg體質(zhì)量給予補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方灌胃,1次/d,連續(xù)14 d。

治療結(jié)束后的次日，采用頸椎脫臼法處死小鼠，并按照無菌操作的原則用酒精消毒皮膚，置于超凈工作臺(以紫外線燈消毒60 min),采用無菌操作手術(shù)方法剝?nèi)∧[瘤結(jié)節(jié)，剔除纖維包膜和壞死組織(正常組取胰腺組織),-40 ℃冰箱中保存。

1.6 主要實(shí)驗(yàn)儀器試劑

紫外分光光度計產(chǎn)自752-P上海現(xiàn)科儀器有限公司，冷凍離心機(jī)為neofuge 15R heal force,磁力攪拌器79-1產(chǎn)自常州澳華儀器有限公司，電泳儀DYY-6C產(chǎn)自北京六一儀器廠，暗匣 AX-Ⅱ產(chǎn)自廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司，封口機(jī)PF PF-S-200產(chǎn)自溫州市江南機(jī)械廠,SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、細(xì)胞總蛋白提取試劑盒、磷酸化蛋白酶抑制劑購自谷歌生物,Tween-20 0777 Amresco,HRP標(biāo)記山羊抗兔KPL,HRP標(biāo)記兔抗山羊KPL,HRP標(biāo)記兔抗小鼠KPL,HRP標(biāo)記兔抗大鼠KPL,牛血清白蛋白(BSA)Roche,PVDF膜(0.45 μm IPVH00010 Millipore),蛋白marker(10～170 kDa)actin Sc-1616r Santa,SIRT1一抗#2496 CST,HIC1一抗Sc-271499 Santa,Shh一抗#2207 CST。

1.7 實(shí)驗(yàn)方法

1.7.1 組織蛋白提取: 組織塊用冷TBS洗滌3～4次，剪成小塊置于勻漿器。加入5～10倍組織體積本試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入cooktail+磷酸化蛋白酶抑制劑)冰上徹底勻漿。如果需要提高蛋白濃度，可以適量減少該試劑體積。將取得的勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，振蕩。冰浴25 min,期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。10 kg離心5 min,收集上清，即為總蛋白溶液。

1.7.2 蛋白濃度測定(采用Bradford方法測定): 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作,10 mg/mL BSA用生理鹽水稀釋為1 mg/mL,樣品濃度測定,900 μL Bradford加入1 μL待測蛋白和99 μL 0.9%生理鹽水，混勻后在595 nm處檢測吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出各樣本蛋白濃度，測完蛋白含量后，計算含40 μg蛋白的溶液體積即為上樣量，在蛋白標(biāo)本中加入適當(dāng)體積的蛋白上樣緩沖液。沸水浴5 min。

1.7.3 SDS-PAGE電泳: 清洗玻璃板，灌膠與上樣，將玻璃板對齊后放入夾中卡緊，操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。按實(shí)驗(yàn)安排配制分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。約40 min后可棄去膠上層水并用吸水紙將剩余水吸干，按前面方法配5%的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠后將梳子插入濃縮膠中，加足夠的電泳液后上樣電泳，將樣品加入電泳孔中進(jìn)行電泳。濃縮膠電壓75 V,分離膠電壓120 V。電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

1.7.4 轉(zhuǎn)膜: 準(zhǔn)備6張7 cm×9 cm的濾紙和1張大小適中的0.45 μm PVDF膜,PVDF膜在使用前要先用甲醇活化，在加有轉(zhuǎn)移液的盆里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、2塊海綿墊、1支玻棒、濾紙和經(jīng)過活化的PVDF膜，將夾子打開并使黑的一面保持水平。在墊子上墊海綿、3層濾紙，小心剝下分離膠蓋于濾紙上，將膜蓋于膠上，并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊。轉(zhuǎn)膜條件: 200 mA,1 h。

1.7.5 免疫反應(yīng): 將轉(zhuǎn)好的膜于室溫下脫色搖床上用5%的脫脂牛奶(0.5%TBST配)封閉1 h。稀釋一抗(TBS-T溶解的5%脫脂牛奶),4 ℃過夜。用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次,5 min/次。將二抗用TBST稀釋3 000倍，室溫下孵育30 min后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次,5 min/次。

1.7.6 化學(xué)發(fā)光: 將A、B兩種試劑在離心管中等體積混合，將膜蛋白面朝上與此混合液充分接觸,1～2 min后棄盡殘液，包好，放入X光片夾中曝光。根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件。凝膠圖像分析為將膠片進(jìn)行掃描存檔,Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值，以空白組灰度值作為(1.00±0.00),其他組樣本的值為與空白組的比值。

2 結(jié) 果

3組HIC1、SIRT1、Shh蛋白濃度灰度值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),見表1。

表1 3組HIC1、SIRT1、Shh蛋白濃度灰度值比較

與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05。

3 討 論

HIC1和靶基因的HiRE結(jié)合能調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄,SIRT1啟動子部位存在2個HiRE,其轉(zhuǎn)錄活性可以被SIRT1蛋白和HIC1形成的復(fù)合物抑制。HIC1可能和成纖維細(xì)胞生長因子結(jié)合蛋白1(FGF-BP1)啟動子區(qū)域的HiRE結(jié)合，在抑制腫瘤血管形成中發(fā)揮重要作用[10]。除了與HiRE直接接觸發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用外,HIC1還可以和其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合，間接抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄[11]。臨床研究[12]顯示,Sirtinol通過下調(diào)SIRT1表達(dá)來抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡，同時增強(qiáng)化療藥5-氟尿嘧啶的敏感性。

1980年在研究果蠅的基因突變時首次發(fā)現(xiàn)了Hh基因。哺乳動物中存在3個Hh的同源基因[13],分別編碼Shh、Ihh和Dhh蛋白。PTCH和SMOH是靶細(xì)胞膜上兩種跨膜蛋白，在Hh信號傳遞過程中起到受體的作用[14]。當(dāng)不存在Hh時,PTCH抑制SMOH的活性,Ci155與一些體節(jié)極性蛋白在微管上形成復(fù)合物后被蛋白酶水解并釋放出轉(zhuǎn)錄抑制蛋白Ci75進(jìn)入細(xì)胞核，從而抑制目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄[15]。Shh是Hedgehog(Hh)信號蛋白家族成員，在多種器官組織的發(fā)育過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞間相互作用，該信號途徑是由Shh、2個跨膜受體Patched(Ptc)和Smoothed(Smo)組成的受體復(fù)合物。蛋白激酶A以及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli家族(Glil、Gli2、Gli3)等組成在進(jìn)化上高度保守。在正常胰腺的發(fā)育和胰腺癌的發(fā)生過程中,Shh信號途徑發(fā)揮著重要作用。有研究[16]稱,Shh在胰腺癌組織中的陽性表達(dá)率增高，其陽性表達(dá)可能與患者的疾病進(jìn)展有關(guān)，但與患者的遠(yuǎn)期預(yù)后關(guān)系尚不明確。

本研究采用的自擬補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方，其中人參味甘微苦，性微溫，能大補(bǔ)元?dú)猓a(bǔ)肺益脾，是為君藥;黃芪味甘、性微溫，能補(bǔ)氣生陽、益表固衛(wèi)，且能增強(qiáng)人參的補(bǔ)氣功效，是為臣藥;柴胡疏肝透邪，枳殼下氣破結(jié)，一升一降，使中焦郁滯疏解;川芎、莪術(shù)性溫、味辛，活血化瘀，疏肝利膽而為佐藥;地龍及蜈蚣性溫、味辛，能搜邪剔絡(luò)，與柴胡、枳殼、川芎、莪術(shù)配伍能引藥入絡(luò)，從而達(dá)到宣通絡(luò)脈的功效，故為使藥;龍葵性寒，味微甘苦，有清熱解毒之功，亦為佐藥;炙甘草性微溫味甘，制肝和脾而益陰緩急，有調(diào)和諸藥之功，為佐使藥。全方共奏補(bǔ)氣通絡(luò)、解毒消瘤之功。

本研究結(jié)果顯示，在HIC1蛋白濃度方面，空白組最高，模型組蛋白濃度顯著低于空白組(P<0.05),說明造模成功后,HIC1基因轉(zhuǎn)錄能力下調(diào),HIC1蛋白合成下降，故組織中HIC1蛋白濃度降低。治療組HIC1蛋白濃度與模型組無顯著差異(P>0.05),但與空白組比較有顯著差異(P<0.05),說明經(jīng)補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方治療后,HIC1蛋白濃度并沒有恢復(fù)正常，但阻止了其進(jìn)一步下降，這可能與實(shí)驗(yàn)敏感度或治療時間過短有關(guān)。在SIRT1蛋白濃度方面，模型組最高，空白組最低，治療組居中，說明胰腺癌細(xì)胞中SIRT1基因表達(dá)升高,SIRT蛋白合成增加，故組織中SIRT蛋白濃度升高;經(jīng)補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方治療后,SIRT1基因表達(dá)下調(diào)，但仍沒有恢復(fù)到正常水平，其效果是否隨治療時間的延長有所改善，還有待進(jìn)一步觀察。在Shh蛋白濃度方面，模型組最高，空白組最低，治療組居中，說明胰腺癌細(xì)胞中Shh基因表達(dá)上調(diào),Shh蛋白合成增加，故組織中SIRT蛋白濃度升高;經(jīng)補(bǔ)氣通絡(luò)解毒方治療后,Shh基因表達(dá)下調(diào),Shh蛋白合成降低，并恢復(fù)到正常水平。

綜上所述，作者觀察到HIC1蛋白濃度越低的標(biāo)本，其SIRT1蛋白濃度反而越高,Shh蛋白濃度也增高,HIC1蛋白濃度與SIRT1蛋白濃度、Shh蛋白濃度呈反比,SIRT1蛋白濃度與Shh蛋白濃度呈正比，說明HIC1、SIRT1信號通路能影響Shh蛋白的合成。