黃芩對弓形蟲感染小鼠細胞免疫功能影響的實驗研究

王海鳳，張新鵑，荊雪寧，唐賽賽

（山東中醫藥高等專科學校，山東 煙臺 264199）

剛地弓形蟲是一種條件致病寄生蟲，為專性細胞內寄生的原蟲，貓科動物是其終宿主和重要的傳染源，其中間宿主包括人和哺乳類動物等[1]。孕婦和免疫缺陷的人群（如AIDS）僅輕度感染即可引起嚴重的后果。妊娠期感染弓形蟲可影響胎兒的發育，導致流產、早產、死胎、胎兒畸形等不良妊娠結局的發生[2]。AIDS患者感染易導致弓形蟲腦病的出現，嚴重的極易引起死亡[3]。近年來，隨著飼養寵物（尤其是貓）的隊伍不斷壯大，加大了弓形蟲感染的潛在危險。雖然隨著診斷方法的不斷改進，弓形蟲的檢出率得到提高，但弓形蟲病的治療仍是當前棘手的問題。目前臨床上治療弓形蟲病主要以西藥為主，如乙胺嘧啶、磺胺嘧啶等。雖然這些藥物對急性感染者體內速殖子的殺滅和抑制有明顯的作用，但同時也存在較大的毒副作用。中藥是我國醫藥學的瑰寶，有毒副作用小、低殘留的優點，所以越來越多的學者開始將方向聚焦于中藥治療弓形蟲病的研究。在中藥治療弓形蟲感染的實驗報告中，無論單方還是復方制劑，多數涵蓋了對黃芩的研究[4-5]。黃芩又名元芩，為唇形科植物黃芩，以根入藥。黃芩具有抗菌、抗病毒、免疫增強、免疫調節的作用[6-7]。通過黃芩抗弓形蟲感染的實驗研究，明確黃芩不能起到直接的殺蟲作用[8]，但可顯著抑制弓形蟲的增殖[9-10]，從而起到抗感染的作用。弓形蟲感染后機體的免疫是以T細胞介導為主的細胞免疫，參與機體免疫反應的主要有巨噬細胞、T淋巴細胞、NK細胞及其多種細胞因子[11]。為了初步研究黃芩抗弓形蟲感染是否與增強小鼠的細胞免疫功能有關，我們設計了本實驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黃芩 黃芩藥材購自山東中醫藥高等專科學校附屬醫院，品種鑒定合格。取黃芩適量，用純水煎制成1 g/ml的溶液，供實驗用。

1.1.2 小鼠 清潔級健康昆明雌性小鼠70只，鼠齡6～8周，重18～22 g，購自南京君科生物工程有限公司。

1.1.3 弓形蟲強毒株（RH株）速殖子 由山東中醫藥高等專科學校免疫學與病原生物學教研室提供。

1.1.4 試劑 小鼠血清IL-2 ELISA檢測試劑盒，購自上海恒遠生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 弓形蟲蟲體準備 復蘇液氮凍存蟲體，昆明小鼠腹腔接種，54小時轉種一次，共轉種3～4次，收集腹腔液內蟲體，離心去上清，并用無菌PBS調整蟲體濃度為103/ml，嚴格無菌操作，以下操作也保證無菌進行。

1.2.2 動物模型的建立 將健康昆明雌性小鼠70只隨機分為對照組（20只）、感染組（25只）、治療組（25只）。感染組、治療組每只小鼠腹腔注射上述弓形蟲懸液0.5 ml，約含500個速殖子，對照組腹腔注射等量的無菌生理鹽水。治療組腹腔感染后4小時開始灌胃給藥（黃芩藥液），劑量為0.5 ml/鼠，灌藥量為500 mg/d，感染組、對照組給予等量的蒸餾水，灌胃前2小時禁水禁食，連續給藥7天后進行指標檢測。對照組、感染組、治療組小鼠存活量分別為20只、21只、24只。

1.2.3 小鼠外周血中IL-2檢測 于灌胃結束后次日對實驗小鼠進行眼底靜脈取血，收集于0.5 ml無菌EP管中，室溫靜置1小時，3 000 r/min離心10分鐘，采用雙抗體加心法ELISA試劑盒測定小鼠外周血中IL-2細胞因子的含量，嚴格按照試劑盒的說明進行操作。

1.2.4 測定小鼠脾、胸腺指數 稱取小鼠體重（g），脫臼處死后剖開胸腹腔，并分離其脾臟、胸腺，用生理鹽水清洗，濾紙吸干稱重（mg），測定脾、胸腺指數，即：胸腺指數（mg/g）=胸腺重量（mg）/小鼠體重（g）；脾指數（mg/g）=脾重量（mg）/小鼠體重（g）。

1.2.5 小鼠脾淋巴細胞增殖功能檢測 測定小鼠脾、胸腺指數后，將小鼠脾臟勻成勻漿，用200目篩網過濾，制備脾細胞懸液，1 500 r/min離心5分鐘，棄上清，加入適量紅細胞裂解液，震蕩3分鐘，靜置10分鐘后離心（4℃，1 000 r/min）10分鐘，棄上清，用PBS洗2次，含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液重懸，用臺盼藍染色計數，調整細胞密度為5×106/ml[12]。將上述制備的脾淋巴細胞懸液加入96孔U形培養板中，每孔100μl。分別加入 ConA（10 μg/ml）100 μl，使其終濃度為 5 μg/ml，每個標本3個復孔，5%CO2培養箱中培養48小時，培養結束前4小時加入 MTT（5 mg/ml）10 μl，培養結束后 1 500 r/min離心 10分鐘，小心吸去上清，加入100μl，DMSO振蕩10分鐘，使紫色結晶完全溶解，然后靜置15~20分鐘，用酶標儀550 nm檢測各孔吸光度（OD值）[13]。

1.2.6 統計學方法 用SPSS 17.0統計軟件分析結果，用（±s）表示，采用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠外周血清IL-2含量比較（見表1）

表 1 3 組小鼠外周血清 IL-2 含量比較（±s，pg/ml）

表 1 3 組小鼠外周血清 IL-2 含量比較（±s，pg/ml）

注：與對照組比較，#P<0.01；與感染組比較，*P<0.01

組別對照組感染組治療組鼠數20 21 24 IL-2含量38.18±2.01 40.63±2.97#48.57±3.26*

2.2 3組小鼠胸腺指數及脾指數比較（見表2）

表2 3組小鼠胸腺指數和脾指數比較（±s，mg/g）

表2 3組小鼠胸腺指數和脾指數比較（±s，mg/g）

注：與對照組比較，#P<0.01；與感染組比較，*P<0.01

組別對照組感染組治療組鼠數20 21 24胸腺指數1.82±0.17 1.75±0.19 2.08±0.31*脾指數3.44±0.56 3.97±0.66#4.35±0.73*

2.3 黃芩對弓形蟲感染小鼠脾淋巴細胞增殖的影響（見表3）

表3 黃芩對弓形蟲感染小鼠脾淋巴細胞增殖的影響（±s）

表3 黃芩對弓形蟲感染小鼠脾淋巴細胞增殖的影響（±s）

注：與對照組比較，#P<0.01；與感染組比較，*P<0.01

組別對照組感染組治療組鼠數20 21 24脾淋巴細胞OD值0.356±0.054 0.389±0.019#0.415±0.048*

3 討論

在本實驗研究中，通過小鼠脾、胸腺指數的測定，外周血清IL-2含量的測定及用MTT法測定脾淋巴細胞增殖情況，以初步探索黃芩在抗弓形蟲感染時對小鼠細胞免疫功能的影響。在實驗研究中，以500個速殖子作為感染劑量，既保證了感染狀態，又控制了小鼠的死亡率，有利于研究的開展[8]。

3.1 弓形蟲感染小鼠急性期，可誘導細胞免疫

表1~3顯示，感染組與對照組相比，弓形蟲感染小鼠后可引起IL-2含量、脾指數、脾淋巴細胞OD值顯著升高（P<0.01），該實驗結果與苑文英[14]的報道相一致。由此表明，在弓形蟲感染急性期，弓形蟲抗原可激活機體免疫應答，活化T細胞，在體內誘導細胞免疫，并通過效應性T細胞或細胞因子IL-2等抑制蟲體繁殖[11，15]。

3.2 黃芩可提高弓形蟲感染小鼠外周血清IL-2含量

表1顯示，治療組與感染組相比，小鼠外周血清IL-2含量顯著升高（P<0.01），表明黃芩可提高弓形蟲感染小鼠外周血清IL-2含量。IL-2主要是由CD4+輔助T（Th）細胞產生的細胞因子，在小鼠體內，只有Th1亞群可產生IL-2，IL-2可參與細胞免疫應答，增強吞噬細胞介導的抗感染機制的作用，特別是抗細胞內寄生菌的感染，誘導并增強細胞毒性T細胞（CTL）反應，增強CTL等穿孔素的表達[16]。有研究表明，對弓形蟲感染小鼠注射一定劑量的重組IL-2，能明顯增強小鼠抗急性弓形蟲感染的能力，可以顯著延長小鼠的生存時間，并明顯減少慢性感染小鼠腦內包囊的數量，肯定了IL-2在免疫應答中抗弓形蟲感染的作用[17-18]。通過本實驗研究發現，黃芩可提高弓形蟲感染小鼠外周血清IL-2的含量，可能提示黃芩可以通過促進IL-2的分泌和釋放來提高小鼠細胞免疫功能，從而間接達到抗弓形蟲感染的作用。

3.3 黃芩可提高弓形蟲感染小鼠脾、胸腺指數

胸腺是中樞免疫器官，是T淋巴細胞分化成熟的場所，并將成熟的T細胞輸出胸腺，移至外周免疫器官。脾臟是體內最大的外周免疫器官（淋巴器官），是成熟的T、B細胞定居和發生免疫應答的重要場所。因此，脾、胸腺兩個免疫器官的重量在一定程度上可以反映兩個免疫器官內淋巴細胞的數量，從而間接了解體內淋巴細胞總體水平[19]。因此，以胸腺指數和脾指數作為衡量機體免疫功能的重要指標。表2顯示，黃芩可顯著提高弓形蟲感染小鼠脾、胸腺指數（P<0.01）。胸腺指數、脾指數的升高初步表明黃芩可增強弓形蟲感染小鼠的免疫功能，以達到抗弓形蟲感染的目的。

3.4 黃芩可促進弓形蟲感染小鼠脾淋巴細胞增殖

表3顯示，黃芩可使ConA激發的小鼠脾細胞（主要是T淋巴細胞）增殖反應明顯增強（P<0.01），表明黃芩在抗弓形蟲感染過程中可促進T淋巴細胞增殖，提高弓形蟲感染小鼠的細胞免疫功能。同時，黃芩可以提高弓形蟲感染小鼠的胸腺指數、脾指數，可能也與黃芩促進免疫器官內淋巴細胞增殖有關。

綜上所述，黃芩可以顯著提高弓形蟲感染小鼠脾指數、胸腺指數、外周血清IL-2含量及促進小鼠脾淋巴細胞增殖。由此初步認為，黃芩可以通過增強弓形蟲感染小鼠的細胞免疫功能而達到抗弓形蟲感染的作用。另外，黃芩對弓形蟲感染小鼠免疫細胞的具體調節機制及對其他細胞因子的分泌是否也有促進作用，可在后續做進一步實驗研究，以明確黃芩抗弓形蟲感染的詳細免疫調節機制，并為黃芩抗弓形蟲的臨床應用提供理論依據。