抗菌肽Cn-AMP2雙靶點抗菌機制的光譜學研究

王潔 ，吳琦 ，王宏蘭 ，孫曉杰 ，衣同輝 ，郭紅艷 ，齊曉丹 ，劉哲丞

1.齊齊哈爾醫學院物理教研室，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫學院臨床生物化學教研室，黑龍江齊齊哈爾 161000；3.齊齊哈爾醫學院生物化學實驗室，黑龍江齊齊哈爾 161000；4.齊齊哈爾醫學院生物化學教研室，黑龍江齊齊哈爾 161000

傳統抗生素的發現和應用為治療感染性疾病提供了非常有效的途徑，但是細菌對傳統抗生素耐藥性日益嚴重，這導致了人們對尋找新型作用靶點和作用機制的抗菌藥物研究。抗菌肽具有不同于傳統抗生素的作用機制，不易產生耐藥性，是抗生素的理想替代藥物[1]。Cn-AMP類抗菌肽來源于拉丁美洲的綠椰子汁液[2]。抗菌肽Cn-AMP2是一條11個氨基酸組成的酸性多肽（氨基酸序列：TESYFVFSVGM）。該文通過Fmoc固相合成法合成了抗菌肽Cn-AMP2并測定其在不同溶液體系中的二級結構；然后測定了抗菌肽Cn-AMP2的抗菌活性。使用不同光譜探針測定了其對細菌細胞膜和基因組DNA的作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

9-芴甲氧羰基(Fmoc)-氨基酸、Rink amide MBHA樹脂及2,2,2-三氟乙醇(TFE)購自吉爾生化(上海)有限公司;MH肉湯培養基購自北京陸橋技術有限公司。溴化乙錠和PBS溶液購置北京鼎國昌盛有限公司。

大腸埃希菌ML-35購自美國ATCC菌種保藏中心，大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC227 853，銅綠假單胞菌ATCC9027，肺炎克雷伯菌ATCC 700603，金黃色葡萄球菌ATCC25923，表皮葡萄球菌ATCC12228，藤黃微球菌ATCC4698，糞腸球菌ATCC 21912和枯草芽孢桿菌 ATCC6633購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

2545制備型高效液相色譜（Waters公司，美國）;J-815型圓二色光譜儀(JASCO公司，日本)；UV-2550紫外分光光度計（島津公司，日本）；RF-5301 PC型熒光分光光度計（島津公司，日本）。

1.2 抗菌肽Cn-AMP2的合成與純化

采用Fmoc固相多肽合成法合成多肽序列，使用Rink amide MBHA樹脂為載體，9-芴甲氧羰基(Fmoc)-氨基酸為原料進行合成。合成結束后，粗肽用三氟乙酸（TFA）從樹脂上切下來，利用2545制備型高效液相色譜進行制備。采用含0.1%TFA的雙蒸水（A相）和含0.1%TFA的乙腈（B相）為流動相，用1 mL/min流速采用ACQUITY UPLC BEH300色譜柱進行梯度洗脫，收集純品進行真空冷凍干燥得到多肽樣品并進行質譜鑒定。

1.3 抗菌肽Cn-AMP2最低抑菌濃度MIC測定

將保存的菌株涂布LB固體培養基平板，于37℃培養24 h。挑取單克隆菌落接種MH液體培養基，37℃，180 rpm過夜振蕩培養。用MH培養基將過夜培養的菌液稀釋到 5×105CFU/mL，按 90 μL/孔加入到 96 孔細菌培養板中；將抗菌肽Cn-AMP2從1 mg/mL開始倍比稀釋后，按10 μL/孔加入到菌液中；然后于 37℃，180 rpm，培養 24 h；測定 OD590nm，計算最低抑菌濃度MIC。重復操作3次，計算MIC平均值[3]。

1.4 抗菌肽Cn-AMP2二級結構測定

在25℃條件下，使用圓二色光譜儀測定抗菌肽Cn-AMP2的二級結構。分別在KP緩沖液(pH 7.0，50 mmol/L KH2PO4/K2HPO4,100 mmol/L KCl)及含有50%TFE的KP緩沖液中測定75 μmol/L多肽。測定波長范圍OD190nm-OD250nm。使用摩爾橢圓率公式 [θ]=θ/10lCMn計算二級結構。

1.5 抗菌肽Cn-AMP2對細菌外膜滲透性實驗

如果細菌外膜遭到破壞，N-苯基-1-萘胺 （N-phenyl-1-naphthylamine,NPN）會發出強烈熒光。選取大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌，用含有5 mM NPN的pH 7.4，5 mM HEPES緩沖液調整對數生長期的細菌濃度調整為8×108CFU/mL后，加入終濃度為5 μg/mL，2.5 μg/mL和1.25 μg/mL的多肽進行測定。用生理鹽水作為對照組。熒光測定的激發波長為350 nm、發射波長為420 nm。

1.6 抗菌肽Cn-AMP2與EB競爭性結合基因組DNA的熒光光譜

按照文獻報道方法提取大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的基因組DNA。取濃度為500 μg/mL的大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA溶液（含1.5 μg/mL EB）50 μL 加入加入等體積的抗菌肽 Cn-AMP2，37℃避光孵育10 min。用OD535nm波長激發，測量反應體系在OD550nm-OD750nm波長范圍的熒光強度。

2 結果

2.1 抗菌肽Cn-AMP2的合成及純化結果

使用Fmoc固相合成方式合成抗菌肽Cn-AMP2后，將冷凍干燥獲得的粗肽用15%的乙腈溶解后，使用Waters 2545型高效液相色譜進行制備，收集多肽純品并進行質譜鑒定（圖1）。抗菌肽Cn-AMP2理論分子量為1 266.42 Da，質譜鑒定為1 266.40 Da（圖2）。質譜鑒定結果表明多肽序列合成正確。

圖1 抗菌肽Cn-AMP2純化結果

圖2 抗菌肽Cn-AMP2質譜鑒定結果

2.2 抗菌肽Cn-AMP2最低抑菌濃度MIC測定結果

采用微量肉湯稀釋法測定抗菌肽Cn-AMP2的最低抑菌濃度，實驗結果表明抗菌肽Cn-AMP2對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌都具有良好的殺傷效果，最低抑菌濃度在 50.0～100.0 μg/mL（表 1）。 實驗結果說明抗菌肽Cn-AMP2是一條具有廣譜抗菌活性的多肽。

表1 抗菌肽Cn-AMP2最低抑菌濃度MIC測定結果

2.3 抗菌肽Cn-AMP2二級結構測定結果

使用了KP緩沖液模擬生理環境，使用KP緩沖液/TFE混合溶液模擬細菌細胞膜疏水環境。在KP緩沖液中，抗菌肽Cn-AMP2在OD222nm波長處橢圓率為590 degree·cm2·dmol-1， 表明抗菌肽 Cn-AMP2 的結構為無規卷曲結構。但在KP緩沖液/TFE混合溶液，抗菌肽Cn-AMP2在OD222nm波長處橢圓率為-2 548 degree·cm2·dmol-1，表明抗菌肽 Cn-AMP2 的結構為螺旋結構（圖3）。

圖3 抗菌肽Cn-AMP2在不同溶液體系中的二級結構

2.4 抗菌肽Cn-AMP2對細菌外膜滲透性實驗結果

細菌外膜滲透性實驗中，當不同濃度的抗菌肽Cn-AMP2與大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌作用后，熒光染料NPN產生了強烈熒光（圖4、圖5）。實驗結果熒光染料NPN在2～3 min左右插入到細菌細胞外膜的疏水性核心區。說明細胞膜是抗菌肽Cn-AMP2的作用靶點之一。

圖4 抗菌肽Cn-AMP2與大腸埃希菌細胞膜作用結果

圖5 抗菌肽Cn-AMP2與金黃色葡萄球菌細胞膜作用結果

2.5 抗菌肽Cn-AMP2與EB競爭性結合基因組DNA的熒光光譜

抗菌肽Cn-AMP2加入到基因組DNA和溴化乙錠EB的混合體系后，EB-DNA復合體系的熒光強度發生明顯的衰減，并且隨著抗菌肽Cn-AMP2濃度增加熒光強度不斷降低；說明抗菌肽Cn-AMP2與EE竟爭性結合大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA，基因組DNA是抗菌肽Cn-AMP2的作用靶點之一[4]（圖 6、圖 7）。

圖6 抗菌肽Cn-AMP2與大腸埃希菌基因組DNA作用結果

圖7 抗菌肽Cn-AMP2與金黃色葡萄球菌基因組DNA作用結果

3 討論

隨著細菌耐藥性問題的日益嚴重，抗菌肽的研究受到了廣泛重視。抗菌肽殺傷病原菌的機理研究中，研究者多關注抗菌肽與細菌細胞膜的相互作用，并提出了“桶板模型”“地毯模型”“蟲孔模型”和“膜區分模型”等來解釋抗菌肽。隨著研究的深入，基因組DNA,DnaK酶等胞內靶點也受到研究者的重視。抗菌肽PR-39和Lfcin等通過與胞內靶點結合，從而對細菌的基因表達及RNA轉錄等產生抑制作用，最終導致細菌死亡[5]。抗菌肽AN5-1和抗菌肽AN5-2則是對細胞膜和基因組DNA都產生作用，從而提高了抗菌活性[6]。

該次通過Fmoc固相合成的方式制備了抗菌肽Cn-AMP2，為了檢測抗菌肽Cn-AMP2的抗菌活性，選取了8種臨床常見的病原菌株。MIC測定結果表明抗菌肽Cn-AMP2對多種革蘭陰性菌和革蘭陽性菌具有殺傷作用，最低抑菌濃度為50.0～100.0 μg/mL。針對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌比較，抗菌肽Cn-AMP2的抗菌活性無明顯區別。以往文獻報道中，抗菌肽Cn-AMP2對白色念珠菌等的抑菌濃度為80 μg/mL左右，說明抗菌肽Cn-AMP2具有廣譜抗菌活性[7]。圓二色光譜測定表明抗菌肽Cn-AMP2在222nm波長處有特征吸收，說明其結構是α螺旋結構。目前已經發現的2 800多種抗菌肽中，α螺旋結構抗菌肽所占比例最高，說明抗菌肽Cn-AMP2的結構屬于抗菌肽中最常見的二級結構。α螺旋結構抗菌肽的作用靶點多為細菌細胞膜，膜滲透性實驗結果確認了細菌的細胞膜是Cn-AMP2的作用靶點之一。熒光光譜實驗證明細菌基因組DNA是抗菌肽的另一個作用靶點，抗菌肽Cn-AMP2引發DNA結構發生變化，從而影響細菌基因組DNA的轉錄翻譯，最終導致細菌死亡。這說明和抗菌肽AN5-1和NK-18相似，抗菌肽Cn-AMP2也是雙靶點作用抗菌肽，但對于抗菌肽Cn-AMP2對基因組轉錄翻譯的具體影響過程，尚需要進一步研究。