骨髓間充質(zhì)干細胞逆轉支氣管哮喘小鼠氣道重構及其機制

任冬花 關 巍 馮喜英 李西玲 趙 立

(西寧市第二人民醫(yī)院呼吸科，青海 西寧 810003)

支氣管哮喘的發(fā)生及不斷發(fā)展與大量的細胞參與密不可分。這些細胞包括淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、調(diào)節(jié)性T細胞及氣道上皮細胞等同時這些細胞分泌的大量細胞因子也都參與了這一過程。近來研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的移植可以有效改善過敏性氣道炎癥〔1～4〕。究其原理發(fā)現(xiàn)，首先BMSCs的多向分化能力，移植的BMSCs在生理刺激下快速分化形成氣管類細胞〔5〕，同時還有免疫調(diào)節(jié)作用〔6～8〕，BMSCs可以調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg的比例，從而改善氣道炎癥，具有治療支氣管哮喘的臨床前景。同時BMSCs不易被機體的免疫細胞所識別，可以有效逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊排斥反應，從而達到治療目的。本研究探討B(tài)MSCs逆轉支氣管哮喘小鼠氣道重構的作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，SPF級8周齡雄性SD大鼠27只，體重(200±10)g(青海大學醫(yī)學部動物實驗中心)，CKX31型倒置顯微鏡(日本 Olympus 公司)，DMEM、胰酶、EDTA(Gibco公司，美國)，TaqMix(東盛生物公司)，培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，10 cm2培養(yǎng)皿、96孔板(美國 Corning 公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)，超凈工作臺SCW-HS-840型 (蘇州市長春電子儀器廠)，培養(yǎng)箱(Queue systems TM2711美國)，深低溫冰箱(SANYO，AltraLow日本)，全能型高性能臺式冷凍離心機(Heaeus，BiofugeStratos德國)，蒸汽高壓消毒箱(Tuttnauer，2540MK美國)，細胞計數(shù)板 (SCW-HZ型上海醫(yī)療設備廠)，卵清蛋白 (OVA，Sigma公司)，Al(OH)3凝膠 (Sigma公司)，流式細胞儀，Anti-CD25-PE (美國BD公司)，Anti-CD45-FITC(美國 BD公司)。

1.2BMSCs的培養(yǎng) 采用SPF級SD大鼠，用水合氯醛麻醉，在嚴格無菌條件下分離出大鼠股骨，用DMEM沖洗骨髓腔后，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次后用DMEM混懸細胞，加入淋巴分離液，分離得到淋巴細胞，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代。

1.3實驗動物分組及給藥 實驗分為哮喘組(10只)，治療組(10只)，空白對照組(10只)。哮喘組和治療組分別在1 d、8 d使用OVA腹腔注射致敏，第15、16、17天使用OVA氣道內(nèi)滴入激發(fā)哮喘。空白對照組在第14天激發(fā)后腹腔注射2 ml含1×107個BMSCs的培養(yǎng)液。空白對照組全部采用等量PBS處理。

1.4支氣管肺泡灌洗液提取及檢測 造模完成后48 h，采用0.3%戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠后，將大鼠氣管切開，插管，生理鹽水0.5 ml/次，重復灌洗2次。將取得的支氣管肺泡灌洗液，1 500 r/min離心10 min，PBS清洗2次，然后將細胞沉淀用100 ml PBS重懸，取10 μl用于細胞總數(shù)計數(shù)，光學顯微鏡進行細胞分類，計數(shù)200個細胞，計算嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞各占的百分比。

1.5取血進行酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測 對大鼠經(jīng)眼眶摘眼球采血，滴入肝素抗凝管內(nèi)，3 000 r/min離心20 min，將血清裝移至另外干凈的1.5 ml EP管中，-20℃保存，待測血清白細胞介素(IL)-4及干擾素(IFN)-γ含量。

1.6取血進行流式檢測 對大鼠經(jīng)眼眶摘眼球采血，滴入肝素抗凝管內(nèi)，取 50 μl 血標本，加入 5 μl鼠抗CD4-PE、5 μl鼠抗CD25-FITC，混勻，避光孵育20 min，加入紅細胞裂解液1 ml，混勻，避光孵育10 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，再用 PBS 2 ml洗1遍，棄上清，加入 200 μl PBS，用流式細胞儀(BD 公司)檢CD4+CD25+Treg。

1.7病理切片檢測 采集血液及肺泡灌洗液后將各組大鼠處死取出肺組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋后進行切片，進行HE染色，觀察病理學改變。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件進行方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1BMSCs的分離及純化 將淋巴分離液分離到的骨髓細胞接種于培養(yǎng)瓶中，在 24 h后可見細胞貼壁，72 h后洗滌細胞除去未貼壁的細胞，7 d左右形成數(shù)十個細胞集落，細胞快速增長，培養(yǎng)2 w后細胞長滿70%～80%，進行細胞傳代。在光學纖維鏡下觀察細胞均成梭形細胞集落，見圖1。

圖1 BMSCs培養(yǎng)48 h的形態(tài)(×200)

2.2肺泡灌洗液細胞計數(shù)情況 小鼠構建支氣管哮喘模型成功后肺部出現(xiàn)炎癥反應，在肺泡灌洗液細胞計數(shù)上的主要表現(xiàn)為，嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞的比例都顯著升高，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 各組肺泡灌洗液細胞分類計數(shù)

與空白對照組比較：1)P<0.01，下表同

2.3各組IL-4、IFN-γ的水平 哮喘組和治療組IL-4水平較空白對照組明顯升高，IFN-γ水平較空白對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 各組血清IL-4和IFN-γ水平比較

2.4各組外周血CD4+CD25+Treg的表達情況 哮喘組CD4+CD25+Treg的比例〔(3.10±1.23)%〕較空白對照組顯著減少〔(5.62±0.45)%,P<0.01〕，治療組CD4+CD25+Treg比例〔(5.12±3.45)%〕較哮喘組顯著增高，但顯著低于空白對照組(P<0.05)。

2.5肺組織HE染色結果 與空白對照組相比，哮喘組與治療組可以看到顯著的炎癥細胞如中性粒細胞、嗜酸性粒細胞的浸潤，同時在血管和支氣管附近也有炎癥細胞的遷移，同時血管附近還有水腫的現(xiàn)象。在小氣道則出現(xiàn)上皮細胞的破壞及上皮層的增生，還有部分地方可以見到有黏液栓出現(xiàn)，見圖2。

圖2 各組肺組織HE切片結果(×200)

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘發(fā)生時氣道會出現(xiàn)一系列的變化，主要表現(xiàn)為大量炎癥細胞的浸潤包括肥大細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等，這些細胞的活化和增殖能夠導致多種細胞因子、毒性蛋白及其他脂類等物質(zhì)的釋放〔9～12〕。這些物質(zhì)可以直接或間接損傷氣道結構，使氣管上皮黏膜大量脫落同時還有部分出現(xiàn)黏液栓塞〔13，14〕。 目前支氣管哮喘發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘的發(fā)生和發(fā)展不僅和氣道的局部環(huán)境有關而且還有全身免疫器官和免疫細胞的參與。特別是Th1/Th2的平衡失調(diào)情況，出現(xiàn)Th2活化而Th1數(shù)量減少，這是支氣管哮喘發(fā)生的重要原因之一〔15～20〕。而IFN-γ和IL-4作為Th1/Th2細胞的代表因子，也被公認為能夠調(diào)節(jié)哮喘的發(fā)生和發(fā)展過程。支氣管哮喘時，IL-4不斷增加，增加的IL-4可以刺激Th0細胞不斷向Th2分化，從而誘導B細胞的增殖、分化及活化〔21，22〕。同時還可以刺激B細胞分泌IgE因子，增加內(nèi)皮細胞分泌T細胞和嗜酸性粒細胞的能力。在Th2不斷增殖時則會抑制Th1的產(chǎn)生，從而導致IFN-γ分泌減少〔23～25〕。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘組和治療組IL-4明顯增加，同時IFN-γ顯著減少，進一步驗證了在支氣管哮喘過程中Th1/Th2比例出現(xiàn)了失衡。

研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘的發(fā)生同時伴隨外周的免疫缺陷的機制的發(fā)生〔11，26～29〕，CD4+CD25+Treg是調(diào)節(jié)細胞，可以調(diào)節(jié)自身免疫耐受的機制。因此支氣管哮喘的發(fā)生同時會影響CD4+CD25+Treg細胞的比例，近期研究發(fā)現(xiàn)通過檢測治療后支氣管哮喘患者發(fā)現(xiàn)治療后患者CD4+CD25+Treg比例明顯升高。

MSCs是一類來源于骨髓中胚層的非造血干細胞，其具有多種的分化潛能，是目前廣泛應用的生物工程種子細胞〔7，30，31〕。BMSCs作為種子細胞的優(yōu)勢主要為：①BMSCs具有不斷分化及增殖的能力，因此BMSCs可以用于治療和損傷的修復工作；②免疫耐受性，BMSCs具有逃避免疫細胞和免疫器官損傷的特性因此采用BMSCs進行移植治療可以避免其他移植的排斥反應從而應用于身體各個部位的損傷治療；③免疫調(diào)節(jié)性能，研究發(fā)現(xiàn)BMSCs具有調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg的功能，通過調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg的比例，同時減少炎癥細胞和炎癥因子的數(shù)量〔32，33〕;④易分離且易培養(yǎng)，BMSCs可以從股骨中分離出來，且體外培養(yǎng)條件比較成熟使其在分離和培養(yǎng)的過程都比較容易實現(xiàn)。BMSCs 主要是通過調(diào)節(jié)肺氣道損傷的微環(huán)境來進一步治療支氣管哮喘，同時BMSCs還可以有效防止支氣管哮喘后期肺部的纖維化和膠原聚集的現(xiàn)象〔34，35〕。

綜上所述，BMSCs可以移植后可以有效遷移到肺損傷部位，同時通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境可以達到逆轉支氣管哮喘小鼠氣道重構的目的，其治療機制可能與CD4+CD25+Treg及細胞因子等有關。但BMSCs治療效果與淋巴細胞的具體反應機制還需后續(xù)研究。