蝦青素聯合人羊膜間充質干細胞移植治療去卵巢大鼠骨質疏松

雷 鳴 劉春穎 劉曉峰 孫 琳 臧衛東 曹廣民 楊照宇 鄭文奎

(河北大學附屬醫院骨科，河北 保定 071000)

骨質疏松發病率較高〔1,2〕，其主要特點為骨組織微觀結構不完整，骨密度降低〔3〕，骨組織生成和代謝的平衡被打破〔4〕，臨床上多表現為身體骨骼部位疼痛、長骨易骨折、身高變低〔5〕等。其機制可能與雌激素調節相關〔6,7〕。對實驗雌性動物摘除卵巢，成功模擬了由絕經后低雌激素水平引起的骨質疏松〔8〕。人羊膜間充質干細胞(hAMSCs)來源廣泛，對產婦及新生兒幾乎沒有影響，且其分化、增殖能力具有獨特的優勢〔9,10〕，未出現傳代后衰老的現象，并有特有的胎盤屏障，羥酮結構的蝦青素，是從深海藻體、海洋動物中提取的胡蘿卜素〔11〕，也存在于少數的陸生植物體內。蝦青素具有很高的醫學價值，研究者已發現其在心血管、抗氧化、抗癌及增強免疫力方面效果顯著〔12〕。本研究探討蝦青素聯合hAMSCs對雌激素下降引起的骨質疏松的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雌性未孕Wistar大鼠60只，鼠齡6～8個月，體重200～280 g，由河北醫科大學動物實驗室提供。所有大鼠飼養條件為：23～27℃，恒溫，濕度50%～70%，喂養飼料：顆粒型普通大鼠飼料及消毒無菌水，讓其自由飲水和進食，實驗前1 d禁食不禁水。

1.2主要材料及來源 hAMSCs購自河北生命科學研究院，由本實驗室冷凍保存。L-DMEM培養基、胎牛血清和混合抗生素(青霉素、鏈霉素)購自Gibcos公司，胰蛋白酶購于Sigma公司，Ⅰ型前膠原氨基末端肽(PINP )、骨堿性磷酸酶(BAP)和尿脫氧吡啶啉(DPD)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于上海船夫生物科技有限公司，RT-PCR試劑盒購于TaKaRa公司，骨形成蛋白(BMP)4、護骨素(OPG)抗體購于Proteintech公司，GAPDH抗體購于Bioworld公司，二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體)購自優維寧生物技術公司，RIPA 裂解液購于碧云天公司。紫外分光光度計購于上海奧析原，二氧化碳培養箱購于上海人和科技有限公司，細胞培養皿、細胞培養瓶購于上海百研生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1體外培養hAMSCs 小心取出已凍存的hAMSCs(防止冷凍管爆裂)，放入37℃水浴，不間歇、輕輕搖動冷凍管，迫使其充分融化時間1 min，融解后，放置于無菌操作臺中，吸取解凍完成的細胞懸浮液，加至預先配置好的1∶10倍稀釋的L-DMEM培養基。并將細胞接種于培養瓶中，靜置于37℃、5%CO2的飽和濕度培養箱中培養。每2天更換新鮮培養液，除去未貼壁細胞，至細胞融合85%時，去除培養基，吸取貼壁細胞，加至培養皿中，3 g/L胰酶消化5 min，用已配置的等體積的10%胎牛血清低糖培養基終止消化，細胞吹打到成懸液，1 500 r/min，離心5 min，棄去上清非貼壁細胞，在新配置的無菌培養基中調節濃度，依照上述方法進行培養。2～3 d更換新鮮培養基，第5代(P5)供于該研究，并進行油紅O染色。

1.3.2大鼠雙側卵巢切除術及實驗分組 無菌條件下，將需切除雙側卵巢的大鼠取俯臥位，捆綁固定大鼠四肢，將大鼠置于手術臺上，消毒，切開皮膚，分離脊柱旁1 cm、肋弓下緣1 cm的肌肉和組織，腹膜切開，見腹腔中乳白色組織，剝離后，切除雙側黃豆大小粉紅色卵巢。空白組大鼠依上述方法去腹腔卵巢大小脂肪。手術組和空白組大鼠撒青霉素粉，皮膚縫合，外切口涂抹慶大霉素消毒。

將60只Wistar大鼠平均分為四組，分別是假手術組、模型組、hAMSCs移植組及聯合組(蝦青素+hAMSCs移植)。對假手術組大鼠不切除卵巢，對模型組、hAMSCs移植組及聯合組大鼠行雙側卵巢切除術。術后1 w，hAMSCs移植組大鼠尾靜脈注射濃度為2×106L-1的hAMSCs細胞懸液20 μl，聯合組尾靜脈注射等量hAMSCs細胞懸液并同時灌胃20 mg/kg的蝦青素，假手術組、模型組大鼠尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液20 μl，連續干預12 w。

1.3.3檢測體重 分別于造模后的1 w、3 w、6 w、12 w對假手術組、模型組、hAMSCs移植組及聯合組大鼠進行體質量檢測。即將每組大鼠排便后且喂食前，放置天平上，進行稱量，記錄大鼠體重。

1.3.4ELISA測定 PINP、BAP、DPD的含量 ELSIA固相抗體為待測樣品抗體，固相抗體與待測樣品發生特異性反應，反應產物與酶標抗體結合形成復合物，加入底物，顯色后進行檢測。造模12 w后，隨機從假手術組、模型組、hAMSCs移植組及聯合組選3只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，斷頭取血，將血漿離心20 min，速度1 000 r/min。移液槍吸取上清液，加入酶標包被板上，1∶10比例稀釋后，加至酶標板孔底部，不間歇輕搖，混勻。用封板膜覆蓋后，37℃，恒溫箱，放置30 min。此時，稀釋洗滌液30倍。摘除封板膜，自然烘干，每孔各滴入洗滌液，靜止1 min后，甩干，多次重復洗滌。每孔加酶標試劑50 μl，排除空白孔，37℃，恒溫箱，放置30 min，多次洗滌，每孔分別加入顯色劑A和B 50 μl，混勻，37℃，暗室，放置15 min后，加入終止液50 μl?？焖伲诜止夤舛扔嬒聹y定450 nm波長下的OD值。

1.3.5RT-PCR檢測BMP-4及OPG基因表達水平 總RNA從移植12 w后的骨細胞中提取，對假手術組、模型組、hAMSCs移植組及聯合組已處死的3只大鼠骨組織中，剝離股骨肌肉組織，取少量股骨粉碎后，加入含1 mg/ml亞鐵離子的PBS多次反復沖洗，用勻漿器打勻，并過100 mm濾膜，備用。按Gibco公司Trizol Total Isolation Reagent 說明書進行提取總RNA并以總RNA mRNA為模板，參照說明書的逆轉錄酶法反轉錄合成cDNA，在擴增儀上進行RT-PCR。吸取2 μl的懸浮細胞液，正反向引物各加入1 μl懸浮細胞液。BMP-4的上游引物為：5′-TGAGCCTTTCCAGCAAGTTT-3′，下游引物為：5′-AGATCCCGCATGTAATCAGG-3′，擴增目的基因片段長度為341 bp。OPG的上游序列為：5′-AGTGGGAGCAGAAGACAT-3′，下游序列為：5′-TGGA CCTGGTTACCTATC-3′，擴增目的基因片段長度為264 bp。內參物GAPDH的上游序列為：5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，下有序列為：5′-TGGACTCCACGACGTACTCA-3′,擴增目的基因片段長度為306 bp。BMP4反應循環條件如下：94℃變性60 s，94℃退火30 s，59℃30 s，72℃ 60 s，35WH 循環，最終72℃延伸10 min〔20〕。OPG反應循環條件如下：95℃變性1 min,57℃ 60 s，72℃ 60 s，35循環，最終70℃延伸1 min。GAPDH反應循環條件為：94℃變性15 s，94℃ 15 s，59℃退火30 s，72℃30 s，40循環〔22〕，最終72℃延伸10 min。將PCR產物10 μl于1.2%瓊脂糖凝膠電泳30 min，采用凝膠自動成像及分析系統，電泳結果用凝膠圖像分析系統分析電泳條帶光密度值，計算光密度與GAPDH的光比值。

1.3.6Western印跡檢測BMP-4及OPG蛋白表達水平 術后12 w，剝離假手術組、模型組、hAMSCs移植組及聯合組已處死的3只大鼠骨組織，用PBS溶液洗滌3次，加入100 μl 含有蛋白抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA細胞裂解液(預先冰浴10 min)，測定蛋白含量。4%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，15 mA電泳1 h后，取下凝膠，蛋白條帶電轉膜至聚偏氟乙稀(PVDF)膜，將轉移完成的PVDF膜放入培養皿，加入5%脫脂奶粉，浸過PVDF膜即可，封閉1 h。分別與多克隆兔抗體BMP-4和抗體OPG(1∶250)反應，陰性對照組與GAPDH(1∶1 000)抗體反應。一抗稀釋后放入培養皿中，加入PVDF膜，4℃恒溫過夜，過夜振蕩孵育后，取出PVDF膜，用TBST液沖洗多次，每次浸潤5 min。與二抗反應，常溫下振蕩孵育2 h，取出PVDF膜，用TBS液沖洗多次，每次浸潤5 min。按照電化學發光(ECL)說明書操作步驟，對PVDF膜進行熒光染色，液體A和液體B等量混合后，將其加入PVDF膜正面，反應1 min，置于暗室10 min，曝光、顯影、定影，通過Alpha2200圖像分析儀對各組條帶掃描拍照，進行半定量分析。

1.4統計學方法 采用SPSS13.0軟件行t檢驗及采用方差分析

2 結 果

2.1hAMSCs的形態觀察 原代hAMSCs形態各異，顯微鏡可見菱形、圓形、不規則形，體積偏小，且可見少量雜質細胞。當細胞融合達到85%左右時，反復培養和傳代，本研究細胞傳至第3代時，形態較規則，多為長窄梭形，體積增大，生長速度增快，出現細胞偽足，未能觀察到雜細胞，見圖1。

2.2各組大鼠體重變化 假手術組大鼠體重增長符合動物自然生長規律，術后1 w，模型組、hAMSCs移植組及聯合組體重均低于較假手術組。術后3 w，hAMSCs移植組及聯合組體重漸增，其中hAMSCs移植組增大幅度較小，大幅度增大的聯合組體質量與假手術組較為接近，而模型組的增長趨勢不明顯，見表1。

圖1 hAMSCs形態觀察(×200)

表1 各組不同時期體重變化

與模型組比較：1)P<0.05；與hAMSCs移植組比較：2)P<0.05，下表同

2.3各組PINP、BAP、DPD的含量變化 模型組DPD明顯高于假手術組，hAMSCs移植組則明顯低于模型組，聯合組又明顯低于hAMSCs移植組差異有統計學意義(P<0.05)。與假手術組差異無統計學意義(P>0.05)。hAMSCs移植組及聯合組BAP明顯高于模型組(P<0.05)，假手術組BAP最高，聯合組接近假手術組(P>0.05)。與假手術組比較模型組PINP明顯降低，hAMSCs移植組和聯合組PINP明顯升高(P<0.05)，聯合組明顯高于hAMSCs移植組(P<0.05)，聯合組與假手術組接近(P>0.05)，見表2。

表2 各組DPD、BAP和PINP比較

2.4BMP-4及OPG mRNA表達水平 假手術組BMP-4mRNA(1.89±0.10)和OPG mRNA(1.95±0.13)表達水平最高，聯合組BMP-4mRNA(1.89±0.10)、OPG mRNA(1.79±0.14)表達水平略低于假手術組且明顯高于hAMSCs移植組(0.94±0.09，1.02±0.09)，而模型組BMP-4mRNA(0.48±0.09)和OPG mRNA(0.56±0.10)表達水平最低，各組間差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組BMP-4和OPG mRNA表達

2.5BMP-4及OPG蛋白表達水平 BMP-4和OPG蛋白表達在假手術組(1.68±0.11、1.74±0.12)、模型組(0.24±0.08、0.33±0.09)、hAMSCs移植組(0.88±0.10，0.94±0.11)及聯合組(1.57±0.12，1.68±0.14)與其相對應的mRNA表達水平呈相關性，即假手術組BMP-4和OPG蛋白表達水平最高，聯合組和hAMSCs移植組二者表達水平依次降低，模型組最低，各組間差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組BMP-4和OPG蛋白表達

3 討 論

Ⅰ型原發性骨質疏松是由雌激素水平低下引起的〔1〕，骨吸收的增量大于骨形成的增量，引起的微觀骨結構發生改變，骨小梁變細、數目降低、出現斷裂現象〔12〕，甚至骨表面出現孔隙、骨表層變薄，脆性增加〔13〕，嚴重可導致全身骨病〔14〕。目前，研究者公認雌激素可以調節分布于骨細胞的雌激素受體，改善成骨細胞能力，提高骨形成。hAMSCs是一種極具分化潛能的干細胞〔15,16〕，在細胞分化增生方面起到非常重要的作用〔17,18〕。PINP和BAP調節著成骨細胞中胞質的合成和儲存，可靈敏地反映骨吸收情況，DPD則起到Ⅰ型膠原纖維分子間的連接作用〔19〕，與破骨細胞含量有關。Ⅰ型膠原纖維降解后，DPD作為產物釋放，故檢測血清中的DPD可反映機體骨吸收情況。BMP-4和OPG均有骨保護作用〔20,21〕，BMP-4分子量較小，可誘發骨形成，可促進成骨細胞分泌骨形成因子〔22,23〕。OPG是對破骨細胞起調節作用的糖蛋白，可有效減弱破骨細胞的生成并阻礙其發揮作用〔24〕。本研究顯示拆除雙側卵巢的大鼠骨密度下降，而同時聯用hAMSCs和蝦青素可扭轉大鼠去卵巢情況，可能對破骨細胞的活性起到制約作用，其原因可能與促進了BMP-4和OPG的分泌，進而保護成骨細胞，并抑制了破骨細胞的釋放有關。