川陳皮素對(duì)糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙的影響

張紅蕊 王耕銀 崔昌萌 黃 蕊 劉春梅 趙軼群 高曉紅 李春霞 李 偉 鄭 佳

(唐山市人民醫(yī)院，河北 唐山 063000)

糖尿病認(rèn)知功能障礙(DMCI)嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，很多學(xué)者認(rèn)為發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激、海馬神經(jīng)元凋亡有關(guān)。目前認(rèn)為核因子E2相關(guān)因子(Nrf)2-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號(hào)通路與DMCI有關(guān)，其抗氧化應(yīng)激作用是研究的熱點(diǎn)。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)是該通路激活后大量產(chǎn)生的抗氧化蛋白，是谷胱苷肽(GSH)合成的關(guān)鍵限速酶之一，由調(diào)節(jié)活力、催化活力兩部分亞單位組成。γ-GCS的含量活性改變可以直接影響GSH合成,轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平升高時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，保護(hù)中樞神經(jīng)。血紅素氧合酶(HO)-1，也是Nrf2通路中重要的抗氧化蛋白酶。Caspase-12即凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸酶12，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵分子，表達(dá)量的變化可以反映ERS的活性，川陳皮素(NOB)主要提取于中藥陳皮中，同槲皮素共屬多甲氧基黃酮類(lèi)化合物，在抗炎、抗氧化、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、肝保護(hù)〔1〕等方面有重要作用。本研究旨在探討NOB對(duì)糖尿病大鼠海馬γ-GCS、HO-1、Caspase-12表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 12周齡健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，清潔級(jí)，40只，體重(300±20)g，由華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。按照華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)有關(guān)條例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。主要藥物及試劑：NOB(陜西慧科生物科技有限公司)、鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)、β-actin抗體(北京中杉金橋)、兔抗γ-GCS、HO-1、Caspase-12多克隆抗體(美國(guó) KPL公司)、抗體稀釋液(碧云天生物科技研究所)、十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠試劑盒(碧云天生物科技研究所)、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)、SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳液粉劑(碧云天生物科技研究所)等。儀器設(shè)備：Morris水迷宮及分析軟件(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研發(fā))、體重秤、高速低溫離心機(jī)、電泳轉(zhuǎn)移槽和垂直電泳儀(北京六一儀器廠)、溫控?fù)u床(XMOOOLDR-MLM)(北京中西遠(yuǎn)大)、凝膠成像分析系統(tǒng)(FluorChen 5500)(美國(guó)Thermo)。

1.2建立模型 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w。禁食不禁水16 h后，隨機(jī)選取32只大鼠單次腹腔注射1%STZ(60 mg/kg)溶液〔由0.1 mol/L的枸櫞酸緩沖液(pH4.4)配制，濃度為10 g/L〕，72 h后用血糖儀檢測(cè)大鼠尾血非空腹血糖，兩次血糖值均>16.67 mmol/L者視為造模成功，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，余8只大鼠設(shè)為正常對(duì)照組，予等劑量緩沖液腹腔注射。

1.3分組及給藥 將造模成功的32只糖尿病大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分組：糖尿病組(n=8)，NOB高劑量組(n=6)、中劑量組(n=6)和低劑量組(n=6)，α-硫辛酸組(陽(yáng)性對(duì)照組，n=6)。另8只大鼠設(shè)為正常對(duì)照組。選用NOB干預(yù)，按10 mg/kg,20 mg/kg 30 mg/kg劑量，分別予低、中、高三劑量組每日腹腔注射。陽(yáng)性對(duì)照組每日予腹腔注射α-硫辛酸60 mg/kg。正常對(duì)照組、糖尿病模型組均予每日腹腔注射等量生理鹽水。以上6組均每日給藥1次，連續(xù)8 w。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食水，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

1.4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 22周齡時(shí)，行Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)(由固定人員完成，并不了解大鼠具體分組情況)。(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：在隔音及人工照明環(huán)境下，一共進(jìn)行5 d的測(cè)試，每天記錄大鼠的成績(jī)。池水每天更換，約30 cm深，21～24℃水溫。圓形水池高50 cm，直徑214 cm，深30 cm，溫度約20℃，用4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)把水池分為4個(gè)象限，選一象限放置圓形平臺(tái)。大鼠面對(duì)池壁下水，記錄其爬到平臺(tái)時(shí)間。如果120 s內(nèi)未到站臺(tái)，則120 s為潛逃潛伏期。輪換進(jìn)行，記錄成績(jī)。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)第6天時(shí)把平臺(tái)撤走，記錄120 s內(nèi)大鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間。

1.5灌注取材 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠空腹過(guò)夜8 h。之后每組隨機(jī)選取4只大鼠進(jìn)行心臟灌注，予10%水合氯醛(3.0 ml/kg) 行腹腔注射麻醉，開(kāi)胸暴露心臟，行左心室插管，同時(shí)將右心耳剪開(kāi)，用生理鹽水灌注，至眼球肝臟變白時(shí)，以4%中性多聚甲醛灌注固定，快速將腦組織完整取出，并迅速分離海馬組織，裝到凍存管，用液氮冷凍后，放置于-80℃冰箱儲(chǔ)存。

1.6Western印跡檢測(cè) (1)制備蛋白樣品，將RIPA裂解液加到各組樣本中，充分裂解后，離心并取出上清。按照BCA法對(duì)蛋白濃度測(cè)定。(2)SDS-PAGE電泳：加好蛋白樣品后，恒壓電泳直到溴酚藍(lán)到凝膠底部時(shí)。(3)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜：通過(guò)半干轉(zhuǎn)法把蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。(4)封閉：取出膜后，封閉在3%牛血清白蛋白(BSA)-Tris-Hcl緩沖液(TBST)中，放在搖床上60 min。(5)孵育一抗：將1∶1 000稀釋的一抗加入，4℃搖床上過(guò)夜。TBST漂洗。(6)孵育二抗：將稀釋的二抗加入，室溫條件下?lián)u床上育60 min，TBST漂洗。(7)蛋白檢測(cè)：膜上加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)5 min。曝光膠片，顯影、定影。用凝膠成像分析系統(tǒng)分析條帶。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在5 d的測(cè)試中，各組潛逃潛伏期均呈下降趨勢(shì)。第2天開(kāi)始，與正常對(duì)照組相比，糖尿病組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，提示STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降。從第3天開(kāi)始，與糖尿病組比較，NOB各劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組潛逃潛伏期明顯縮短(P<0.05，P<0.01)，以高、中劑量組變化更顯著(P<0.01)，且高劑量與中劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2空間探索實(shí)驗(yàn) 與正常對(duì)照組相比，糖尿病組目標(biāo)象限停留的時(shí)間顯著縮短(P<0.01)；與糖尿病組相比，NOB各劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組目標(biāo)象限停留時(shí)間均延長(zhǎng)(P<0.05，P<0.01)，以中、高劑量組更為顯著(P<0.01)，但未恢復(fù)正常，且高劑量與中劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明川陳皮素可以緩解記憶能力的損傷。見(jiàn)表1。

表1 各組Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中潛逃潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間比較

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01;與糖尿病組比較：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

2.3Western印跡檢測(cè)結(jié)果 正常對(duì)照組海馬CA1區(qū)γ-GCS、HO-1、Caspase-12低水平表達(dá)。糖尿病組海馬CA1區(qū)γ-GCS、HO-1、Caspase-12表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯增加(P<0.01)。與糖尿病組比較，NOB各劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組海馬CA1區(qū)γ-GCS、HO-1表達(dá)明顯升高(P<0.05，P<0.01),而Caspase-12表達(dá)均有所下降(P<0.05，P<0.01)，以NOB中、高劑量組變化最顯著(P<0.01)，但高劑量與中劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 各組海馬CA1區(qū)γ-GCS、HO-1、Caspase-12表達(dá)

表2 各組海馬CA1區(qū)γ-GCS、HO-1、Caspase-12的表達(dá)

3 討 論

海馬結(jié)構(gòu)與學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)，研究認(rèn)為DMCI時(shí)海馬結(jié)構(gòu)功能受損。高血糖可透過(guò)血腦屏障損害神經(jīng)元而降低患者學(xué)習(xí)、推理、記憶等能力。自由基氧化應(yīng)激損傷學(xué)說(shuō)及ERS誘導(dǎo)凋亡是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)〔2〕，認(rèn)為二者均與DMCI有關(guān)。

正常情況下GSH和80%的γ-GCS結(jié)合使細(xì)胞失活,在GSH減少時(shí)與其結(jié)合的γGCS釋放就會(huì)增加,γ-GCS的水平隨之升高。有報(bào)道〔3〕Nrf2-ARE信號(hào)通路激活可以減少GSH的消耗、神經(jīng)興奮性毒素等對(duì)神經(jīng)元的損害，增加神經(jīng)元的能量、氧化還原電位抑制性神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)和代謝過(guò)程，起到保護(hù)中樞神經(jīng)的作用。Nrf2是抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子，ARE與其相互作用，調(diào)節(jié)下游抗氧化蛋白的表達(dá)〔4〕，在減輕細(xì)胞損傷中具有重要的作用〔5〕，對(duì)糖尿病氧化應(yīng)激腦損傷起到保護(hù)作用。萊菔硫烷可激活Nrf2-ARE抗氧化通路，上調(diào)下游的Ⅱ相酶如HO-1等的表達(dá)，清除自由基，減少腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡及保護(hù)血-腦脊液屏障〔6〕。外源性或內(nèi)源性應(yīng)激激活Nrf2后，可以上調(diào)γ-GCS、HO-1表達(dá)水平。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)容易受機(jī)體內(nèi)環(huán)境的影響，氧化應(yīng)激即可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致未折疊蛋白的聚集或者錯(cuò)誤折疊，從而引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)。此反應(yīng)一定程度上有保護(hù)作用，但是過(guò)度時(shí)將通過(guò)ERS導(dǎo)致相關(guān)性細(xì)胞凋亡。Caspase-12是ERS通路中一種重要的調(diào)控蛋白，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。其表達(dá)水平在腦缺血再灌注損傷后明顯升高。高糖可使ERS反應(yīng)激活，活化的Caspase-12可激活Caspase-3、Caspase-9引起細(xì)胞凋亡。NOB有抗炎、抗氧化〔7〕、抗癌、抗血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化〔8〕等作用。有報(bào)道〔9〕黃酮類(lèi)化合物甘草黃酮也可以增強(qiáng)糖尿病大鼠抗氧化能力，降低丙二醛(MDA)水平，可推斷NOB在糖尿病大鼠DMCI中可具有此作用；枳實(shí)、陳皮含有NOB、桔皮素活性成分，對(duì)缺血性腦卒中有一定的預(yù)防作用；研究〔10〕提出，NOB可以減輕大鼠腦缺血后腦水腫、神經(jīng)功能受損而保護(hù)中樞神經(jīng)；NOB可改善阿爾茨海默病大鼠的認(rèn)知功能,有效改善腦缺血導(dǎo)致的認(rèn)知功能下降。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元中有少量的γ-GCS、HO-1、Caspase-12的表達(dá)，考慮為生理狀況下的表達(dá)量。糖尿病大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙，學(xué)習(xí)記憶能力損傷嚴(yán)重，表現(xiàn)為大鼠潛逃潛伏期延長(zhǎng)、在空間探索實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)象限停留時(shí)間縮短，海馬CA1區(qū)γ-GCS、HO-1、Caspase-12表達(dá)量較正常組升高，一方面考慮是大鼠高血糖透過(guò)血腦屏障，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強(qiáng)產(chǎn)生大量有毒物質(zhì)從而損傷了海馬神經(jīng)元；另一方面是高糖致ERS誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元的凋亡，活化的Caspase-12表達(dá)水平上升進(jìn)一步激活其他凋亡因子的表達(dá)而損害神經(jīng)元。這種情況下，機(jī)體啟動(dòng)Nrf2-ARE通路，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2活性增強(qiáng)、表達(dá)增多，通過(guò)與ARE作用，增加γ-GCS、HO-1等表達(dá)，抵御氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)元的損害。NOB治療大鼠認(rèn)知功能改善，γ-GCS、HO-1表達(dá)量升高，NOB可能會(huì)使γ-GCS、HO-1表達(dá)增多而增強(qiáng)組織細(xì)胞抗氧化能力，保護(hù)海馬神經(jīng)元；Caspase-12表達(dá)水平下降，表明NOB可以抑制海馬細(xì)胞凋亡，減輕認(rèn)知功能損傷，機(jī)制可能與過(guò)度的未折疊蛋白反應(yīng)中下調(diào)Caspase-12表達(dá)量等有關(guān)。將來(lái)可細(xì)化NOB的藥物作用濃度，更深入地探討NOB對(duì)DMCI的作用強(qiáng)度的曲線(xiàn)變化。

綜上，NOB對(duì)改善糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙有較好的作用，表明NOB可以保護(hù)海馬神經(jīng)元，機(jī)制可能與Nrf2-ARE信號(hào)通路激活導(dǎo)致γ-GCS、HO-1等抗氧化應(yīng)激因子大量表達(dá)及抵抗在過(guò)度的未折疊蛋白反應(yīng)中Caspase-12途徑所致的細(xì)胞凋亡相關(guān)。