電針聯合癌痛貼對骨癌痛大鼠脊髓背角TLR9及TLR9 mRNA的影響

關江鋒 王 兵 王 珊 胡作為 楊 航

(武漢市第一醫院腫瘤科，湖北 武漢 430022)

骨癌痛(BCP)是大部分惡性腫瘤伴隨的癥狀，還可引發嚴重的心理疾患，不利于患者預后〔1,2〕。電針聯合癌痛貼用于緩解惡性腫瘤BCP疼痛臨床效果明顯，但其鎮痛機制尚不明確。Toll樣受體(TLR)9屬于Ⅰ型跨膜受體蛋白，在先天性免疫和獲得性免疫之間發揮橋梁作用，研究顯示TLR9參與了BCP的發生與持續〔3,4〕。本課題擬考察電針聯用癌痛貼用于大鼠BCP的可能機制。

1 資料與方法

1.1受試大鼠和Walker256大鼠乳腺癌細胞 雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠(體重200～220 g)共80只，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2002-2003，所有大鼠自由飲水攝食。Walker256大鼠乳腺癌細胞購自武漢生物醫學工程研究所。

1.2BCP大鼠的制備 采用水合氯醛腹腔注射麻醉，固定在操作臺，剃凈左側后肢的毛，消毒脛骨，切開脛骨上段，暴露脛骨骨面，用牙鉆在脛骨打孔，用微量注射器向脛骨骨髓腔緩慢注射10 ml含有3×103Walker256傳代大鼠腹水瘤的細胞懸液，注射后用骨蠟封閉鉆孔處，醫用酒精沖洗，縫合傷口，青霉素涂抹傷口防感染。

1.3分組和給藥 將大鼠隨機分為對照組(健康大鼠)、模型組、鎮痛貼組和電針聯合鎮痛貼組，每組20只。鎮痛貼組：實驗前，在大鼠背部對稱兩側脫毛，面積為3 cm×3 cm，在各大鼠一側皮膚敷貼癌痛貼，12 h后去除貼劑，連續給藥12 d，癌痛貼主要由蟾酥、生川烏、蚤休、莪術、細辛、乳香和沒藥配伍制得，由武漢市中西醫結合醫院制劑室碾成粉末，以一定比例加入基質制成藥膏。鎮痛貼組和電針聯合鎮痛貼組：處理同鎮痛貼組，同期給予電針治療，在安靜環境下，將大鼠軀干固定在自制固定器上，頭部與四肢均可自由活動，將針灸針刺入大鼠左側“足三里”(ST36)與“昆侖”(BL60)穴，通過韓氏神經刺激儀給予“疏密波”，頻率2/100 Hz，強度以引起大鼠后肢肌肉輕微抖動而不嘶叫為宜，隔日給予電針治療，每次30 min，連續給藥12 d，模型組針灸刺入大鼠學位后，不通電。

1.4機械性痛覺超敏測定 分別在給藥前、給藥中和給藥結束測定大鼠機械性痛覺超敏。在安靜環境中，大鼠適應20 min，用一系列規格的Von Frey 細絲(0.4、0.6、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 g)按一定順序刺激刺激大鼠左側足中部，觀察并記錄大鼠縮足反應，每根細絲的刺激時間為1～2 s，前后兩次不同刺激間隔10 min，計算出50%的Von Frey反應閾值，作為機械性痛閾值。

1.5大鼠后肢抓力測定 分別在給藥第0、6、12天、采用平衡式測痛儀(中國醫學科學研究院生物醫學工程研究所，天津)測定大鼠機械性痛覺超敏。將大鼠放置于特質的有機玻璃格子內，前肢趴在格子的斜面上，雙側后肢分別踏在兩個獨立的傳感器上，待大鼠安靜后開始檢測，檢測左右側后肢負重差值在10 s的計分，每只大鼠連續檢測5次，取均值。

1.6脊髓背角TLR9表達 大鼠在10%水合氯醛下麻醉，暴露心臟，經左心室插管，灌入適量生理鹽水，沖洗干凈血液，灌入4%多聚甲醛250 ml，固定后，取脊髓腰膨大節段，置于4%多聚甲醛中固定2 h，再分別置于10%、20%和30%蔗糖溶液中，梯度脫水至組織沉淀，OCT包埋，冠狀冰凍切片。

1.6.1RT-PCR檢測脊髓背角TLR9 mRNA水平 大鼠斷頭，立即在冰浴中取脊髓，將脊髓置于1.5 ml EP管中，每50 mg組織中加入1 ml Trizol試劑，冰浴下勻漿。每1 ml Trizol試劑加入0.2 ml氯仿，震蕩15 s，水浴5 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，取上層水相置于另一個EP管，加入等體積異丙醇，冰浴15 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，棄上清，加入75%乙醇洗滌，7 500 r/min，4℃離心15 min，棄上清，傾去乙醇，空氣干燥，將干燥后沉淀置于DEPC水中，在紫外分光光度計下檢測OD260和OD280，評估RNA的純度。以β-actin為內參，TLR9上游引物：5′-TTTCCGGCTAGGGAATGGTTCCC -3′，下游引物：5′- TTAAACCAATGAAAGGTAAT 3′，β-actin上游引物：5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′，下游引物：5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAC-3′。逆轉錄在0.2 ml無RNase的PCR管內依次加入：70℃變性5 min，冰浴5 min，37℃水浴60 min，95℃水浴5 min，冰浴5 min，得到cDNA。PCR擴增反應體系：94℃ 5 min，94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 10 min 35個循環。將PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠影像分析儀成像，分析條帶的吸光度，比較各組條帶與對照組條帶的灰度比。

1.6.2Western印跡檢測脊髓背角TLR9水平 大鼠處死后，取脛骨，加裂解液，冰浴勻漿，離心取上清液，取至新的EP管中，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白含量測定。將大鼠脊柱骨用液氮研磨后加入RIPA置于冰上裂解，并將裂解后的蛋白樣品轉移至100℃水浴加熱5 min使蛋白變性。Bio-Rad DC Protein Assay Kit蛋白定量，統一總蛋白上樣量為40 μg。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)蛋白電泳后，轉膜，分別加入Anti-TLR9和β-actin 一抗(兔抗鼠)按說明書1∶1 000稀釋，4℃過夜。加入二抗(1∶5 000稀釋)，電壓15 V，60 min膜的封閉：5%脫脂奶粉/PBST 20 ml，水平搖床，室溫封閉2 h。加ECL-plus發光顯示液體，曝光，電泳條帶經Image J軟件處理，分析各組條帶與對照組條帶面積。

1.7腫瘤局部組織的炎癥因子含量檢測 剝離大鼠右后肢，鉆孔取腫瘤組織，以每100 mg加預冷的500 μl Aim Plex Tissue Lysis緩沖液，勻漿，低溫離心留上清，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測白細胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α。

1.8統計學方法 使用SPSS19.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組大鼠不同時間痛閾值及后肢抓力比較 與對照組比較，給藥6、12 d后其余各組機械性痛閾值及后肢抓力均明顯降低(P<0.05)，與模型組比較，鎮痛貼組和電針聯合鎮痛貼組均明顯增高(P<0.05)，與鎮痛貼組比較，電針聯合鎮痛貼組均明顯增高(P<0.05)，見表1。

表1 各組不同時間痛閾值及后肢抓力比較

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與鎮痛貼組比較：3)P<0.05；下表同

2.2各組大鼠治療后脊髓背角TLR9 mRNA和TLR水平比較 與對照組(0.7±0.2，0.4±0.1)比較，模型組TLR9 mRNA和TLR水平(1.3±0.3，1.5±0.5)明顯增高(P=0.000)，與模型組比較，鎮痛貼組(0.7±0.3，0.7±0.2)和電針聯合鎮痛貼組(0.4±0.2，0.3±0.1)均明顯降低(P<0.05)，與鎮痛貼組比較，電鎮聯合鎮痛貼組均明顯降低(P<0.05)，見圖1。

A～D：對照組、模型組、鎮痛貼組、電針聯合鎮痛貼組圖1 各組治療后脊髓背角TLR9 mRNA和TLR比較

2.3各組大鼠治療后腫瘤局部組織炎癥因子比較 與對照組比較，其余各組IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明顯增高(P<0.05)，與模型組比較，鎮痛貼組和電針聯合鎮痛貼組均明顯降低(P<0.05)，與鎮痛貼組比較，電針聯合鎮痛貼組均明顯降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組治療后腫瘤局部組織炎癥因子比較

3 討 論

BCP對應中醫“骨疽”或“骨蝕”的范疇，中醫認為疼痛的發病機制在于體內氣血淤阻，經絡不通，不通則痛。治療BCP在于活血化瘀和行氣止痛〔5,6〕。癌痛貼方中蟾酥蟾蜍表皮腺體的分泌物，具有攻毒、解毒和止痛的功效；川烏為毛莨科植物烏頭的干燥母根，可祛風除濕，溫經散寒、祛瘀止痛；蚤休具有消諸瘡，除無名腫毒及消腫止血的功效；細辛祛風散寒，通竅止痛的功效；莪術可行氣破血消積止痛，乳香與沒藥相須為用，共奏活血止痛和消腫生肌的功效。諸藥聯用具有溫經散寒通絡和解毒活血化瘀的功效，多年來用于治療和緩解各種惡性腫瘤相關的癌痛均有明顯效果〔7～10〕。本課題結果提示癌痛貼有助于改善BCP癥狀。

TLRs屬于高度保守的Ⅰ型跨膜蛋白，在先天性免疫與獲得性免疫間發揮作用，近年來研究發現TLRs參與識別內源性組織損傷相關分子模式，在關節炎及腦脊髓炎缺血/再關注等無菌性炎癥的發生發展發揮作用〔11〕。TLR9是TLRs家族中的一員，可識別內源性自身DNA中低甲基化和細菌/病毒DNA中未甲基化的CpG序列，TLR9不僅在免疫細胞中表達，也在中樞神經系統表達，尤其在小膠質及星形膠質細胞表達，被激活的TLR9可刺激炎性成分細胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性細胞因子大量表達，引起促炎因子“瀑布”反應，引發疼痛〔12，13〕，另外TLR9的配體能夠增加TRPV1調節的鈣離子(Ca2+)內流，間接發揮疼痛調節作用。TLR9敲擊的自身免疫性腦脊髓炎小鼠浸潤的炎性細胞和脫髓鞘病灶均弱于野生型小鼠，進一步提示TLR9可能參與了疼痛的產生〔14〕。本課題結果顯示，TLR9參與了BCP疼痛的發生與持續。癌痛貼可顯著降低BCP大鼠脊髓背角TLR9及TLR9 mRNA表達，與骨癌帖的組成及有效成分密切相關，如蟾酥所含的有效成分華蟾毒精能夠影響TLRs信號傳導通路中多種基因的表達，降低TLR9等多種模式識別受體相關基因的表達，促進NFKBIA等NF-κB抑制蛋白的相關基因表達，控制過度炎癥反應〔15〕；含有川烏的舒筋蠲痹湯可通過抑制類風濕關節炎大鼠血清及病變局部的TLR9表達〔16〕；莪術所含的異龍腦和姜黃素可抑制HaCaT細胞分泌的TLR9和TLR2表達〔17〕。

中醫認為疼痛緣起于風、寒、暑、濕、燥、火或痰濕瘀血等外邪阻滯經絡，導致經絡不通，加上“風、寒、濕三氣雜至合而為痹”，因而不通則痛。BCP所致的疼痛也屬于經絡不通所致的不通則痛范疇，電針可調和氣血，疏通活絡，活血止痛，電針對炎癥痛或神經痛等多種急慢性疼痛均有較好的鎮痛作用。本課題選擇“足三里”(ST36)與“昆侖”(BL60)進行電針，有助于后肢病理性疼痛，臨床研究顯示患者接受電針時，當發生“得氣”時才發揮作用，即“行針者，貴在得神取氣”，而采用電針治療，與傳統的“捻轉提插”的針法類似，使得針刺部位“得氣”〔18,19〕。

綜上，與單純使用癌痛貼比，癌痛貼聯用電針用于大鼠BCP的鎮痛作用明顯，鎮痛的可能機制與降低脊髓背角TLR9及TLR9 mRNA表達相關。