海仁藻酸致癇對老年大鼠腦NMDA亞單位R1蛋白表達的影響

趙吉波 房艷宇 王 澍 劉宏斌

(齊齊哈爾醫學院附屬三院神經內科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

癲癇也稱羊癲瘋，屬于慢性疾病，是大腦神經元突發性異常放電，最終導致大腦功能障礙〔1〕。據不完全統計，我國癲癇年發病率約為0.028 8%，1年內發作的活動性癲癇發病率約為4.25%〔2，3〕。其臨床表現復雜多樣，可表現為自主神經、精神障礙。迄今為止，其發病機制尚不清楚，增加了癲癇的臨床診斷及治療難度。已有學者指出〔4〕，N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)亞單位的構成及其功能對于選擇抗癲癇藥物、減少不良反應有較大作用。本文進一步探討海仁藻酸致癇對老年大鼠腦NMDA亞單位R1蛋白表達的影響。

1 資料和方法

1.1一般資料 選取36只成年(24月齡)無特定病原體的雄性大鼠，體重240～320 g，平均(278.21±12.52)g。大鼠飼養及其取材均嚴格遵守動物管理及保護的相關規定。實驗動物購買后，實驗室內飼養6 w，隨機分為6組各6只，對照組平均體重(274.25±12.85)g；假手術組(280.25±14.25)g；海仁藻酸致癇2 h組(279.55±12.43)g；海仁藻酸致癇6 h組(280.58±11.47)g，海仁藻酸致癇24 h組(278.85±11.85)g，各組體重差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2儀器及試劑 儀器：日本奧林巴斯公司提供的正置焚光顯微鏡、圖像分析系統；美國MDS公司提供的多功能酶標儀；英國SHANDON公司提供的AS325輪轉式切片機；Leica公司提供的石蠟包埋機、小型髙速離心機；青島海爾集團提供4℃冰箱；蘇凈集團安泰公司提供的SW-CJ-IF超凈臺、40×45型電熱恒溫干燥箱、高速離心機；calibrate beads公司提供的流式細胞儀；BAYGENE公司提供的脫色搖床、電泳儀。試劑：Life Technologies提供的生理鹽水；自行配制乙醇、磷酸鹽緩沖液(PBS)、4%中性多聚甲酵固定液、Tris緩沖液。

1.3模型制備 采用10% 0.33 ml/kg水合氯醛麻醉后，于立體定位儀下，將海仁藻酸注入右側杏仁核中，制備癲癇模型。采用5 μl注射器垂直注入杏仁核，將其作為對照組。假手術組：注入1 μl生理鹽水。其他3組則分別按照1 ml/min的速度注入1 μl海仁藻酸，注射完后，留針5 min，緩慢退出。

1.4灌注取材 采用水合氯醛腹腔麻醉后，大鼠仰臥，并對其進行固定；剖開腹腔，充分暴露心臟；將穿刺針從左心室刺入升主動脈，將右心耳剪開；采用200 ml生理鹽水快速灌注，再將250 ml 4% 多聚甲醛灌入；后剖開大鼠大腦，取出腦組織；將其置入灌注液中2 h，經過二甲苯、進臘等完成脫水處理；最后采用石蠟包埋；采用輪轉式切片機連續切片蠟塊，每一個切片厚度約8 μm，以備病理改變觀察。

1.5免疫組化 首先，進行石蠟切片脫蠟，經過100%、95%、85%、75%、50%乙醇及水各1次，5 min/次，采用PBS清洗5 min，3次；其次，置于微波爐中高火且加熱到沸騰，并維持加熱到8 min，待水溫降到室溫；再次，10%正常山羊血清室溫濕盒予以封閉30 min，采用PBS清洗5 min，3次，后進行二氨基聯苯胺(DAB)顯色、水洗等操作；最后，制作成中性樹膠封片，采用自動化圖像分析系統Image-ProPlus Version6.0定量分析免疫組化片的NMDA亞單位R1蛋白，每個切片隨機選取4個高倍鏡視野，對累積光密度值、掃描面積等進行計算，其強度用平均光密度值代表陽性。

1.6流式細胞儀檢測 采用上述老年大鼠腦組織制備腦組織單細胞懸液，采用70%冷乙醇加以固定；采用PBS反復洗滌2次；每1份加入50 μl第一抗體，置于4℃冰箱內，反應45 min；然后采用PBS代替一抗，加入二抗，完成洗滌后；最后采用流式細胞儀檢測。

1.7統計學分析 采用PEMS3.1軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組NMDA R1陽性細胞數密度值比較 海仁藻酸致癇4組NMDA R1陽性細胞數密度值均顯著高于對照組、假手術組(P<0.05)，且海仁藻酸致癇6 h組數值達到頂峰，隨后保持穩定。海仁藻酸致癇4組差異無統計學意義(P>0.05)；對照組、假手術組差異無統計學意義(P>0.05)。海仁藻酸致癇4組海馬CA3、DG區NMDA R1陽性細胞數密度值均顯著高于顳葉皮層，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組NMDA R1陽性細胞數密度值比較

與對照組及假手術組比較：1)P<0.05；與本組顳葉皮層比較：2)P<0.05；下表同

2.2各組NMDA R1蛋白表達水平比較 海仁藻酸致癇2 h、6 h、12 h、24 h組海馬、顳葉皮層區NMDA R1蛋白表達水平均顯著高于對照組、假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)。海仁藻酸致癇6 h組達到高峰，隨后保持穩定，見表2。

表2 各組NMDA R1蛋白表達水平比較

3 討 論

癲癇是一種很常見的慢性神經系統疾病，由多種原因導致的神經細胞異常放電而引起的感覺、意識、行為、自主神經不同程度障礙，可反復發作〔5，6〕。癲癇的發病率較高，可發生于各年齡階段。癲癇通常采取藥物治療，大多數癲癇患者均可以通過藥物治療達到緩解癲癇癥狀的目的，但還有少部分患者藥物治療反應差，此類癲癇可稱為難治性癲癇〔7，8〕。難治性癲癇通過規范化藥物治療后仍無法有效控制癲癇癥狀，即使以后采用更多種抗癲癇藥物治療，癲癇癥狀得到緩解的概率仍然很低。

NMDA分布于中樞神經系統較為明顯的區域，且具有特異性，在海馬及前腦皮層區的密度較高〔9〕。NMDA較為重要的功能單位為NMDA R1亞單位，是由920個氨基酸組成，長度達4 213 bp，可對NMDA R1功能起到調節及修飾作用〔10〕。有研究表明〔11〕，NMDA R1基因紊亂可影響機體內蛋白質的變化，且在癲癇大鼠內NMDA R1表達水平在致癲癇后6 h達到高峰，NMDA R1蛋白可能參與到癲癇發作及發展中。海仁藻酸可通過膜電位削弱Mg2+對NMDA的作用，從而激發性激活NMDA，引起細胞內Ca2+的釋放。本研究結果與相關文獻研究報道一致〔12，13〕。

綜上，海仁藻酸致癇老年大鼠腦NMDA亞單位R1蛋白在癲癇發作及發展中有重要作用，且隨著癲癇發作時間的延長，腦NMDA亞單位R1蛋白水平也隨之升高，可作為癲癇診斷及治療的臨床依據。