依達拉奉對兔動脈靜脈化皮瓣模型血清血管內(nèi)皮生長因子、白細胞介素-1β及腫瘤壞死因子-α的影響

蔣振興 溫菊珍 程曉華 何志軍 宋 淵 李 森 劉 濤

(甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

通過靜脈途徑的動脈血營養(yǎng)使皮瓣存活，為皮瓣的選擇注入新的活力，具有切取部位不受限制、皮瓣薄、切取方便，不需要犧牲主干動脈等優(yōu)點，但其較低的成活率又限制其應用〔1〕。動脈化靜脈皮瓣是一種非生理性皮瓣，移植后皮瓣常處于缺氧狀態(tài)，目前主要以加大皮瓣血流量和提高皮瓣的抗缺血能力來提高皮瓣的成活率〔2〕。依達拉奉已成功地用于治療各種瘀血，具有擴張血管、抗氧化、抗自由基、防止血管內(nèi)皮細胞損傷等廣泛的藥理作用〔3,4〕。本研究擬明確依達拉奉注射液對兔動脈化靜脈皮瓣組織損傷及成活面積影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1動物及藥物 10月齡清潔級健康新西蘭長耳白兔40只，體質(zhì)量(2.5±0.5)kg，生產(chǎn)許可證號為SCXK(甘) 2015-0025，由蘭州生物制品研究所動物實驗中心提供。動物購進后安靜狀態(tài)下適應性飼養(yǎng)1 w，飲水飼料充足，光照節(jié)律12L/12D(7∶00～19∶00)，溫度(23±2)℃，相對濕度(50±10)%。藥物采用依達拉奉注射液(廣西梧州制藥集團公司，國藥準字Z20025652)。

1.2試劑及儀器 HADAIA360全自動熒光磁微粒酶免分析系統(tǒng)/酶聯(lián)免疫分析儀，兔血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白細胞介素(IL)-1β及腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒(購自美國R.D公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3模型分組及制備 按隨機數(shù)字表法分為4組，每組各10只。模型組靜脈皮瓣缺血11.5 h,吻合皮瓣血管，恢復血運；對照組皮瓣缺血時間同模型組，但皮瓣缺血后，恢復血運前用甘露醇灌注皮瓣；治療組皮瓣缺血時間同模型組，但皮瓣缺血后，恢復血運前皮瓣用灌注液為依達拉奉；空白組造兔股內(nèi)側手術切口，不做皮瓣，原位縫合，不用藥。參照文獻〔5〕報道的造模方法，動物以3%戊巴比妥鈉(30～40 mg/kg)靜脈注射麻醉，股內(nèi)側備皮，切取股內(nèi)側皮瓣，大小為7.5 cm×6.9 cm，皮瓣內(nèi)包含股動靜脈及周圍肌組織，結扎股動靜脈、隱動脈以外的血管分支，在蒂部切斷股動靜脈，將股動脈近端與股靜脈遠端縫合，結扎股動脈近端機股動脈遠側端，即形成以動脈化股靜脈為供血支，隱動脈為回流支的軸型股內(nèi)側肌皮瓣，觀察皮瓣血循環(huán)良好后，原位縫合。制成動脈化靜脈皮瓣模型。

1.4干預方法 參考《中藥藥理研究方法學》〔6〕根據(jù)人兔的計量折算系數(shù)確定給藥量。治療組家兔公斤體重依達拉奉劑量50 mg·kg-1·d-1，連續(xù)7 d；對照組，造模后給予低分子右旋糖酐，按照15 ml·kg-1·d-1劑量靜脈注射，連續(xù)7 d；模型組，造模后給予0.9%生理鹽水，按照18 ml·kg-1·d-1劑量靜脈注射，連續(xù)7 d。

1.5檢測指標及方法 ①皮瓣成活率測定：術后1 w，用坐標貼紙法測量皮瓣成活面積。皮瓣成活率=皮瓣成活面積/皮瓣總面積×100%。②在術后第7天，切取皮瓣區(qū)域皮膚組織塊作為標本，置入10%甲醛溶液中固定做HE染色。③血清VEGF、IL-1β及TNF-α含量測定:各組分別于手術前和造模第7天后分別從心臟抽血3 ml,即刻離心，取血清4℃冰箱保存。采用酶聯(lián)免疫法測定大鼠血清VEGF、IL-1β及TNF-α含量，用酶標儀在450 nm波長下測量光密度(OD值)。④MDA和SOD測定:分別于術前、灌注后即刻、恢復血運1、24 h共4個時相，切取皮瓣近段區(qū)域皮膚組織塊作為標本，放于-80℃冰箱或液氮罐中保存，可制成10%的組織勻漿液，隨時檢測MDA活性和SOD含量。

1.6統(tǒng)計學方法 應用統(tǒng)計軟件SAS9.1行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1皮瓣成活率 治療組、對照組皮瓣成活面積普遍較大，治療組、對照組皮瓣成活情況均顯著好于模型組(P<0.01)，治療組和對照組成活情況差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2皮瓣組織切片HE染色、顯微鏡觀察 治療組、對照組表皮層尚完整，組織水腫，周圍出現(xiàn)毛細血管，深層可發(fā)現(xiàn)血管擴張及徑腔變大，管壁內(nèi)有成纖維細胞增生。模型組組織水腫，表皮層有缺損，深層可見炎癥細胞浸潤，多有壞死及結痂組織。見圖1。

2.3血清VEGF、IL-1β及TNF-α含量比較 各組術前血清VEGF、IL-1β及TNF-α含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與空白組比較，治療組、對照組、模型組術后血清VEGF、IL-1β及TNF-α含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較，術后治療組及治療組VEGF水平顯著升高，而IL-1β及TNF-α含量顯著降低(P<0.01)。與對照組比較，治療組術后血清VEGF、IL-1β及TNF-α含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組皮瓣成活面積比較

與模型組比較：1)P<0.01

圖1 各組術后7 d 皮瓣近端HE染色(×20)

表2 各組術前與術后血清VEGF、IL-1β、TNF-α含量比較

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05

2.4皮瓣組織MDA、SOD水平 皮瓣組織MDA含量術前4組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，灌注后即刻、恢復血運1、24 h，治療組、對照組MDA顯著低于模型組，SOD顯著高于模型組(P<0.01)。見表3。

表3 各組皮瓣組織MDA、SOD值比較

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

3 討 論

動脈化靜脈皮瓣移植術中存在短暫的缺血期，當移植皮瓣恢復血流，就會出現(xiàn)不同程度的再灌注損傷。動脈化靜脈皮瓣的靜脈危象臨床表現(xiàn)包括皮膚腫脹和皮瓣顏色變紫、變黑。如果不及時治療，動脈化靜脈皮瓣會發(fā)生壞死。靜脈瘀血導致皮瓣病理改變，毛細血管數(shù)量減少，微血管血流減慢，血栓逐步增加〔7〕。依達拉奉是一種強效的羥自由基清除劑及抗氧化劑，具有擴張血管、減輕心肌炎心肌損傷、抑制血小板凝集、延長凝血時間、清除自由基、抗炎、抗氧化、改善血管恢復等藥理作用，主要用于心腦血管疾病和中樞神經(jīng)疾病的治療，并取得良好效果〔8，9〕。本實驗結果表明依達拉奉能很好地改善兔動脈靜脈化皮瓣移植術后血管危象，可以減輕皮瓣組織水腫，促進血管新生，能夠提高顯微外科手術成功率，不良反應少，安全性好，是一種安全有效地防止血管危象的活血抗凝藥。

動脈化靜脈皮瓣靜脈危象的各個階段均有炎性反應和氧化應激的參與，在皮瓣愈合中起著調(diào)節(jié)與控制的重要作用。IL-1β及TNF-α等炎性因子可促進中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞及淋巴細胞等炎性細胞趨化、黏附、聚集、激活及脫顆粒，釋放溶酶體酶、蛋白水解酶和脂類介質(zhì)等炎性介質(zhì)，從而產(chǎn)生對血管新生的損傷〔10〕。VEGF是肝素結合活性同源二聚體多肽，通過與血管內(nèi)皮上flt和flk/Kdr兩個特殊受體結合，直接刺激血管內(nèi)皮增殖，內(nèi)皮細胞有絲分裂增強，使血管內(nèi)大量生成內(nèi)皮細胞，促進血管形成。IL-1在機體感染、損傷、炎癥及免疫反應等過程中起關鍵作用，存在形式有IL-1α和IL-1β，通過IL-1受體發(fā)揮廣泛的生物學效應〔11〕。IL-1β是一種多效性的細胞因子，是腦缺血再灌注中觸發(fā)炎癥反應的重要介質(zhì)之一，主要由血管內(nèi)皮細胞、膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元等活化表達〔12〕。TNF-α屬于促炎因子，是炎癥反應中出現(xiàn)最早、最重要的炎性遞質(zhì)之一，在免疫激活系統(tǒng)中起重要作用，與其受體TNFR(TNFR-α1、TNFR-α2)結合后，通過激活核轉錄因子(NF)-κB、Jun氨基末端激酶(JNK)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，調(diào)節(jié)細胞炎性反應，并促進其他致炎細胞因子的合成〔13〕。本研究提示炎性因子及VEGF因子參與了動脈化皮瓣靜脈危象的發(fā)生發(fā)展，依達拉奉可通過干預皮瓣靜脈危象炎性因子及VEGF因子的表達，而起到治療作用。

MDA是氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而形成的脂質(zhì)過氧化物,對MDA 的檢測可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化和機體細胞受自由基攻擊的損傷程度〔14〕。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，當體內(nèi)自由基生成增多時，它與超氧陰離子反應生成過氧化氫，再由過氧化氫酶和谷胱甘肽酶轉變成水，從而使自由基清除，保護細胞免受損傷。當皮瓣缺血再灌注時，自由基生成會逐漸增加，導致MDA含量增加，同時自由基也可以破壞SOD，引起SOD失去活力，失活SOD不能有效地清除自由基，使MDA含量進一步升高形成了一種惡性循環(huán)，本實驗說明SOD和MDA之間呈現(xiàn)負相關的生物學特性。依達拉奉可通過抑制體內(nèi)脂質(zhì)過氧化和減少氧自由基對移植皮瓣的損傷，并通過促使提高SOD活性，清除自由基，促進皮瓣新生血管生成，擴張皮瓣血管，增加血流量。

綜上,依達拉奉注射液能減輕脂質(zhì)過氧化反應及提高機體抗氧化能力,并減輕促炎性細胞因子水平，減少皮瓣嗜中性粒細胞浸潤，減輕皮瓣再灌注損傷。