利拉魯肽對糖尿病大鼠腎組織炎癥因子表達(dá)的影響

江思瑜 梁 嬋 李蒙蒙 李雅靖 孫 霓 吳曉光

(承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

糖尿病腎病(DN)是以腎小球硬化伴尿蛋白含量超過正常水平為特點(diǎn)的慢性病，是糖尿病各類并發(fā)癥中危害性最大的一類疾病〔1〕。至今對于其發(fā)病機(jī)制尚無準(zhǔn)確定論，研究認(rèn)為DN的發(fā)生發(fā)展與遺傳變異、糖代謝紊亂、腎臟血流動力學(xué)的改變、氧化應(yīng)激反應(yīng)等因素有關(guān)〔2〕，但最新研究表明〔3〕，炎癥機(jī)制也是DN的發(fā)病原因之一，其中Toll樣受體(TLR)4/髓樣細(xì)胞分化因子(MyD)88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路扮演了極其重要的作用。利拉魯肽作為胰高糖素樣肽的類似物可通過調(diào)節(jié)胰島素的分泌產(chǎn)生降糖作用〔4〕，但其抗炎機(jī)制不甚明了。本文擬分析利拉魯肽對糖尿病大鼠腎組織TLR4/MyD88通路表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 健康SD雄性大鼠68只，體重230～250 g,購于北京市維通利華公司。鏈脲佐菌素(STZ)購于Sigma公司。利拉魯肽針劑購于丹麥諾和諾德公司。磷酸鹽緩沖液(PBS)、TLR4抗體、MyD88抗體、即用型SABC試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、核因子(NF)-κB試劑盒、腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒、白細(xì)胞介素(IL)-6試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將68只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、利拉魯肽組、二甲雙胍組，每組17只。正常對照組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)；模型組、利拉魯肽組、二甲雙胍組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，STZ經(jīng)緩沖液稀釋后按30 mg/kg一次性注射至大鼠腹腔，48～72 h后于大鼠尾靜脈取血，以連續(xù)3 d所測平均血糖≥16.7 mmol/L且尿糖>()為DN大鼠建模成功。模型建立成功后，利拉魯肽組按0.12 mg·kg-1·d-1皮下注射給藥，二甲雙胍組按140 mg·kg-1·d-1灌胃給藥，正常對照組及模型組均給予等量溶媒，實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠均無降糖干預(yù)，連續(xù)給藥8 w。

1.3生化指標(biāo)檢測 飼養(yǎng)大鼠8 w后收集大鼠尿液與血液標(biāo)本。最后一次給藥前24 h，將大鼠放入代謝籠，收集24 h總尿液量，測量尿糖含量后，以1∶100的體積加甲苯防腐劑，充分混勻后，300 r/min離心取上清液，測大鼠24 h尿蛋白含量、24 h尿糖。大鼠3.5%戊巴比妥麻醉，股靜脈插管，收集大鼠血液，4℃ 300 r/min離心取上清液分裝，-80℃冰箱存儲，檢測大鼠尿素氮、血糖、血肌酐。

1.4大鼠腎組織病理觀察 大鼠左心室插管，剪開右心耳，在120 mmHg壓力下注入4℃生理鹽水，至腎臟顏色由紅轉(zhuǎn)蒼白色。剝離身表面包膜，結(jié)扎左腎動脈后，摘取左腎，液氮保存。再以4%多聚甲醛溶液灌注大鼠，取右腎組織，梯度酒精，行石蠟包埋，石蠟切片機(jī)制作5 μm切片，依次脫蠟、浸水、蘇木精染色、鹽酸酒精分化、伊紅染色、脫水、二甲苯透明，光鏡下觀察大鼠腎組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.5SABC免疫組化檢測大鼠腎組織TLR4/MyD88蛋白表達(dá) 取5 μm厚腎組織石蠟切片，依次進(jìn)行脫蠟水化、抗原修復(fù)、3%過氧化氫(H2O2)滅活內(nèi)源性過氧化物酶、山羊血清封閉、枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，滴加按1∶50比例稀釋的TLR4抗體與MyD88抗體、二抗工作液及DAB顯色劑，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片，光鏡觀察各組腎組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測大鼠腎臟NF-κB、TNF-α、IL-6表達(dá) 將腎臟制成勻漿液，經(jīng)300 r/min離心，取上清液按1∶100比例稀釋，檢測大鼠腎組織NF-κB、TNF-α、IL-6表達(dá)。取0.1 ml樣品置于反應(yīng)孔中，37℃孵育1 h，洗滌；加入酶抗體，37℃孵育0.5 h，洗滌；加底物液，37℃下顯色10 min；酶標(biāo)儀450 nm檢測樣品吸光度值，所有操作參照ELISA試劑盒說明進(jìn)行。

1.7統(tǒng)計分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1給藥前后各組24 h尿蛋白含量、24 h尿糖、體重、血肌酐、尿素氮及血糖水平比較 給藥后，與正常對照組比較，模型組、利拉魯肽組、二甲雙胍組體重及所測指標(biāo)水平顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，利拉魯肽組、二甲雙胍組體重明顯增加(P<0.05)，所測指標(biāo)水平顯著下降(P<0.05)；利拉魯肽組、二甲雙胍組各項指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 給藥前后各組24 h尿糖、尿蛋白、血肌酐、尿素氮及血糖水平比較

與正常對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；同表2

2.2給藥后各組腎臟形態(tài)學(xué)比較 光學(xué)顯微鏡下，正常對照組腎組織中腎小球體積正常、基底膜及系膜區(qū)無明顯增寬增厚現(xiàn)象，與正常對照組比較，模型組腎小球體積增大、系膜區(qū)、基底膜增厚明顯增厚；與模型組比較，利拉魯肽組、二甲雙胍組腎小球體積變小，系膜及基底膜厚度明顯變薄，見圖1。

2.3給藥后各組TLR4蛋白表達(dá)水平比較 顯微鏡下，在腎組織中可發(fā)現(xiàn)褐色或棕黃色沉淀，為TLR4蛋白陽性表達(dá)。正常對照組TLR4蛋白微弱表達(dá)(0.55±0.08)，與正常對照組比較，模型組(0.55±0.08)顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，利拉魯肽組、二甲雙胍組(0.37±0.07，0.46±0.10)明顯降低(P<0.05)；利拉魯肽組、二甲雙胍組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

2.4給藥后各組MyD88蛋白表達(dá)水平比較 顯微鏡下，在腎組織中可發(fā)現(xiàn)褐色或棕黃色沉淀，為MyD88蛋白的陽性表達(dá)。正常對照組MyD88蛋白微弱表達(dá)(0.39±0.11)，模型組、利拉魯肽組、二甲雙胍組(0.76±0.16、0.49±0.12、0.62±0.09)明顯增加(P<0.05)，但利拉魯肽組、二甲雙胍組明顯低于模型組(P<0.05)，利拉魯肽組、二甲雙胍組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

圖1 給藥后各組腎臟形態(tài)學(xué)比較(HE，×400)

圖2 給藥后各組TLR4蛋白表達(dá)水平比較(×400)

圖3 給藥后各組MyD88蛋白表達(dá)水平比較(×400)

2.5各組NB-κB、TNF-α、IL-6表達(dá)比較 與正常對照組比較，模型組、利拉魯肽組、二甲雙胍組NB-κB、TNF-α、IL-6表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，利拉魯肽組、二甲雙胍組明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組NF-κB、TNF-α、IL-6表達(dá)比較

3 討 論

國際糖尿病聯(lián)盟發(fā)布的最新消息顯示，在2015年，全球范圍內(nèi)約有4.15億人罹患糖尿病〔5〕。炎癥通路可能是DN進(jìn)展的中心環(huán)節(jié)，目前已成為研究的熱點(diǎn)。TLR是非特異性免疫中重要組成之一，能夠連接特異性免疫與非特異性免疫，并識別多種病原體，由其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了DN的發(fā)生及發(fā)展〔6～8〕。李曼麗等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下，TLR4可以促進(jìn)腎臟細(xì)胞分泌炎癥因子，參與了DN的發(fā)生。TLR4作為發(fā)現(xiàn)較早的TLR相關(guān)蛋白，集中分布于單核巨噬細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等〔10〕，可激活TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子表達(dá)。TNF-α能通過多種途徑使胰島抵抗現(xiàn)象加重并損害胰島β細(xì)胞；IL-1可以促進(jìn)NB-κB的進(jìn)一步激活，放大炎癥信號；IL-6能夠加重炎細(xì)胞浸潤，增加腎毛細(xì)血管的通透性；三者結(jié)合可引起腎臟組織內(nèi)一系列的非特異性免疫與間質(zhì)纖維化，最終引發(fā)DN〔11〕。

MyD88依賴性通路、MyD88非依賴性通路及β干擾素Toll/IL-1受體同源區(qū)(TIR)結(jié)構(gòu)域銜接蛋白依賴通路是目前已知的TLR4介導(dǎo)的信號通路〔12,13〕，其中 MyD88依賴性通路是TLR4的重要組成部分〔14〕，在TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮無法替代的作用。在MyD88依賴通路中，在TLR4/IL-1配體的刺激下MyD88發(fā)生二聚化，同時MyD88羥基端的TIR結(jié)構(gòu)域與Toll的TIR結(jié)構(gòu)域發(fā)生作用、氨基端的死亡結(jié)構(gòu)域(DD)激活I(lǐng)L-1受體相關(guān)激酶(IRAK)家族。IRAK4可以使自身介導(dǎo)的IRAK1磷酸化途徑激活，隨后高度磷酸化的IRAK1與MyD88發(fā)生解離，轉(zhuǎn)而結(jié)合TNF受體相關(guān)因子(TRAF)-6。TRAF-6能夠通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和IκB激酶(IKK)發(fā)生磷酸化，磷酸化的MAPK途徑活化轉(zhuǎn)錄激活蛋白 (AP)-1,磷酸化的IKK途徑激活NB-κB，進(jìn)而激活TNF-α、IL-1、IL-6等各種炎癥分子的轉(zhuǎn)錄，參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生〔15,16〕。本研究結(jié)果提示利拉魯肽能夠抑制TLR4/MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)，降低對大鼠腎臟組織的損害。

利拉魯肽目前已用于治療2型糖尿病，且對DN也具有緩解作用，不僅體現(xiàn)在通過葡萄濃度依賴的促胰島素分泌作用〔17〕，對胰島β細(xì)胞形成保護(hù)，還得益于其抗炎作用，劉璠等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可以使TNF-α、IL-6等炎癥分子的表達(dá)下調(diào)，在一定程度上緩解了糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展。利拉魯肽能夠通過對IKK-β參與炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用，達(dá)到改善胰島抵抗的目的〔19〕；能夠抑制單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、NF-κB的表達(dá)，延緩對腎臟的損害〔20，21〕。本研究提示利拉魯肽抑制了TLR4/MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的IKK途徑，抑制了NF-κB的激活，從而降低了炎癥因子的表達(dá)，對腎臟產(chǎn)生了保護(hù)。