補中益氣湯在轉移性乳腺癌他莫昔芬耐藥中的作用及機制

董合玲 譚慶麟 葉志彬 葉兆康 盧志斌 李 浩 張漢文 吳 敏 吳依芬

(暨南大學體育學院，廣東 廣州 510632)

乳腺癌位于女性癌癥之首〔1，2〕。乳腺癌發展到一定階段后，會有不同程度的轉移。轉移性乳腺癌(MBC)是癌腫經過直接浸潤蔓延或淋巴管、血管等途徑轉移至其他器官并繼續增殖生長，形成與原發瘤同樣性質的癌腫。MBC患者治療后生存時間較長，因此MBC患者的治療至關重要。三苯氧胺(他莫昔芬，TAM)是最基本的內分泌治療藥物，但TAM治療過程中，除了原發耐藥(TAM-R)之外〔3〕，約30%最終產生繼發耐藥〔4〕，導致治療失敗，治療失敗后采取化療副作用大，過程痛苦。因此，探索乳腺癌內分泌耐藥的機制，尋找抑制內分泌耐藥的有效藥物是迫切需要解決的問題。本文研究補中益氣湯逆轉TAM-R而抑制乳腺癌細胞生長的機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 MCF-7細胞(人乳腺癌細胞系，美國ATCC株亞型)；二甲基亞砜(DMSO)、焦碳酸二乙酯(DEPC，美國Sigma公司)；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，MBCHEM公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；TAM(Hoffman-La Roche公司)；補中益氣湯(根據《中華人民共和國藥典》制備)；引物合成(美國Invitrogen公司)；放射免疫沉淀實驗(RIPA)裂解液、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)試劑盒(碧云天生物技術研究所)；SYBR premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa公司)。

1.2實驗方法 MCF-7細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基，待細胞鋪滿皿底面積的90%以上時，取生長狀態好的細胞傳代。正式實驗時，細胞平均種于35 cm六孔板中，以減少組間差異。實驗分5組，分別為MCF-7、MCF-7+TAM、MCF-7+補中益氣湯、MCF-7/TAM-R、MCF-7/TAM-R+補中益氣湯。TAM用量為5 μg/ml，TAM培養液持續培養6個月以上，即誘導產生耐TAM人乳腺癌細胞系MCF-7/TAM-R。補中益氣湯用量為1.5 μg/μl。

1.3MTT檢測細胞存活率 各組細胞貼壁后，根據分組藥物處理18 h，倒置顯微鏡下觀察。然后加入5 mg/ml濃度的MTT溶液，繼續培養4 h。反應末，去除培養基加入150 μl的DMSO低速振蕩10 min后酶標儀測量吸光度。根據公式計算結果，進而評價各組細胞的存活率。

1.4Western印跡檢測雌激素受體(ER)、血管內皮生長因子受體(EGFR)、人表皮生長因子受體(HER)-2、Akt蛋白含量 各組細胞加入200 μl蛋白裂解液〔50 mmol/L Tris-HCl pH8.0，150 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，1 mmol/L二硫代蘇糖醇(DTT)，0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)，25 mmol/L NaF，0.1 mmol/L Na3VO4，100 mg/L苯甲基硫酸氟(PMSF)，2 μg/ml亮抑酶肽，1 μg/ml抑肽酶〕，冰上裂解15 min后收樣，分裝保存在-80℃。Bio-Rad 測定提取上清液中的蛋白質濃度，加上樣緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH6.8，2% SDS，10%丙三醇，2%β-巰基乙醇和0.5‰溴酚藍)，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，1×三羥甲基氨基甲烷(TBS)液洗滌3次，加入二抗，37℃孵育，1×TBS液洗滌3次。電化學發光(ECL)試劑盒顯色，KODAK Image Station 4000MM 圖像系統曝光，分析讀取條帶面積，寬度和灰度值。

1.5qRT-PCR檢測ER、EGFR、HER-2、Akt的mRNA表達 “Primer-Premier 5”軟件設計引物。Trizol 試劑盒提取各組細胞的總mRNA，溶于適量DEPC水后分裝，取適量測其純度和總量，其余于-80℃冰箱保存。使用反轉錄儀將RT反應液中的RNA反轉錄為cDNA，反應條件：37℃15 min；85℃5 s；4℃30 min。將反轉錄好的cDNA于-80℃冰箱保存。PCR操作按照試劑盒說明書進行。PCR反應液混勻后在熒光PCR儀上擴增目的基因：95℃預變性30 s一個循環，然后執行(95℃變性5 s，60℃退火25 s，72℃延伸30 s)45個循環，最后72℃再延伸5 min，反應結束后，采用55～95℃間隔1℃ 2 s進行融解曲線分析。

1.6統計處理 采用SPSS16.0統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1補中益氣湯干預MCF-7/TAM-R細胞存活率 MCF+TAM組和MCF+補中益氣湯組細胞存活率〔(51.1±0.79)%、(59.2±0.28)%〕較MCF-7組〔(83.3±0.62)%〕顯著下降(P<0.05)。MCF-7/TAM-R組細胞存活率〔(82.7±0.53)%〕與MCF-7組無顯著差異。MCF-7/TAM-R補中益氣湯組細胞存活率〔(44.5±0.36)%〕顯著下降(P<0.05)。

2.2補中益氣湯干預MCF-7/TAM-R細胞后蛋白量 MCF-7+TAM組和MCF-7+補中益氣湯組ER、EGFR、HER-2及下游Akt的蛋白量較MCF-7組顯著下降(P<0.05)。MCF-7/TAM-R組與MCF-7組相比，HER-2、Akt、EGFR和ER蛋白量有所上升，無顯著差異。MCF-7/TAM-R+補中益氣湯組ER、EGFR、HER-2及下游Akt的蛋白量均下降。見圖1和表1。

圖1 補中益氣湯干預MCF-7/TAM-R細胞機制蛋白表達

表1 補中益氣湯干預MCF-7/TAM-R細胞機制蛋白表達

與MCF-7組相比:1)P<0.05，下表同

2.3中益氣湯干預MCF-7/TAM-R細胞后基因表達變化 MCF-7+TAM組和MCF-7+補中益氣湯組ER、EGFR、HER-2及下游Akt mRNA表達較MCF-7組顯著下降(P<0.05)。MCF-7/TAM-R組與MCF-7組相比，HER-2和Akt mRNA有所上升，EGFR和ER mRNA表達下降均無顯著差異。MCF-7/TAM-R+補中益氣湯組ER、EGFR、HER-2及Akt mRNA表達均顯著下降(P<0.05)。見表2。

表2 補中益氣湯干預MCF-7/TAM-R細胞基因表達

3 討 論

乳腺癌發展到一定階段后進展為MBC。但是，TAM治療過程中，除了原發耐藥之外〔3〕，約30%最終產生繼發耐藥〔4〕，導致治療失敗。大量臨床研究表明，ER失調和過表達EGFR/HER-2是造成TAM-R的重要機制〔5～7〕；PI3K/AKT/mTOR通路是在ER交互作用中的重要通路，抑制Akt可以抑制ER和EGFR/HER-2的交互作用〔8～10〕。

乳腺癌的治療包括手術治療、內分泌治療、化療放療、運動療法、中醫療法、分子靶向治療等〔11，12〕。中藥療法或運動干預與分子靶向治療的有機結合可提高腫瘤的治療效果〔13～16〕。中醫對于治療乳腺癌的病理機制及發展過程早有記載。補中益氣湯是“益氣升陽”的代表方，方中重用黃芪，配伍人參、炙甘草、白術等諸藥，功用補益脾氣、升陽舉陷、甘溫除熱，使元氣充盛，清陽上升，是臨床上治療脾胃氣虛證的一條有效處方。

補中益氣湯通過下調ER、EGFR、HER-2及下游Akt mRNA表達及蛋白含量，而逆轉了MCF-7細胞對TAM耐藥，從而進一步促進了乳腺癌細胞的凋亡，達到控制乳腺癌的效果。